В аланин: Аминокислота VPLAB Beta-alanine 90 кап. купить в интернет-магазине VPLAB

Мы с радостью вернем деньги за приобретенный на Wiggle товар, если Вы вернете товар в течение 365 дней. Подарочные ваучеры Wiggle и персонализированные товары не подлежат возврату, за исключением товаров с браком.

Возвращать товары необходимо неиспользованными и в оригинальной упаковке, за исключением тех случаев, когда был обнаружен брак. Пожалуйста, свяжитесь с нашей командой поддержки перед возвратом велосипедов или больших товаров.
Wiggle обязуется возместить затраты на пересылку любых бракованных товаров.
Более подробная информация о возвратах

Что такое бета-аланин и кому стоит на него потратиться

Что такое бета-аланин

Бета-аланин — это заменимая аминокислота ^{, которая вырабатывается в печени и в малых дозах присутствует в продуктах животного происхождения. В спортивном питании она выпускается в виде таблеток или порошка.}

Добавки с бета-аланином принимают ^{, чтобы отсрочить утомление мышц во время продолжительной интенсивной работы.}

Когда вы выполняете тяжёлое упражнение долгое время, в мускулах нарастает жжение и боль. Они становятся слабее, а затем и вовсе перестают сокращаться — наступает отказ.

Это происходит потому, что в процессе интенсивной работы тело переходит на бескислородный режим выработки энергии. Из-за этого в мышцах накапливаются ионы водорода (H+), pH-баланс сдвигается в кислую сторону, и наступает ацидоз, или «закисление».

Некоторые органические соединения способны частично нейтрализовать ионы водорода и таким образом отсрочить отказ мышц. Приём бета-аланина может увеличить ^{количество одного из таких веществ — L-карнозин — на 64–119% от исходного уровня, что поможет дольше работать на высокой интенсивности. Правда, происходит это только при определённых условиях.}

Кому стоит попробовать бета-аланин

Согласно исследованиям, приём бета-аланина улучшает ^{результаты забегов на 800–1500 метров, гребли на 2 000 м и плавания на 100–200 метров.}

Также аминокислота может помочь при выполнении высокоинтенсивных интервальных тренировок, например комплексов из кроссфита. Однако здесь всё зависит от времени работы и отдыха. Лучше всего добавка помогает ^{тем, кто выполняет упражнения на протяжении 30 секунд, а затем отдыхает около трёх минут.}

В целом, считается ^{, что самый мощный эффект от добавки можно получить при длительности нагрузок от 1 до 4 минут.}

Несмотря на доказанную эффективность, чудес от добавки ждать не стоит. Как правило, приём бета-аланина обеспечивает ^{лишь небольшую прибавку в производительности — в 2,85%, хотя в некоторых научных работах называют и более впечатляющие цифры: 12–16% после 4–10 недель приёма.}

Кому не пригодится бета-аланин

Бета-аланин не поможет ^{тем, кто хочет побыстрее накачаться или увеличить вес в силовых упражнениях.}

Короткие подходы на развитие силы заканчиваются задолго до того, как в мышцах успеют накопиться ионы водорода, поэтому и эффект будет нулевой. Лучше обратите внимание на протеин и креатин.

Не влияет бета-аланин и на общую выносливость, например на показатели в беге на длинные дистанции или другую не очень интенсивную работу, в процессе которой мышцы не закисляются. Так что если хотите пробежать марафон, не тратьте деньги на эту добавку.

Безопасен ли бета-аланин

В целом, добавка признана ^{безопасной при приёме 1,6–6,4 г в день на протяжении 8 недель. Хотя в некоторых исследованиях атлеты пьют бета-аланин гораздо дольше — вплоть до 24 недель — и не имеют побочных эффектов.}

В некоторых исследованиях указывают, что приём более 800 мг либо 10 мг на 1 кг веса тела за раз может ^{вызвать парестезию — покалывание или жжение лица, шеи, задней части рук или корпуса. Неприятные ощущения длятся от 60 до 90 минут, не вызывают боли и не опасны для здоровья.}

Чтобы предотвратить возникновение побочных эффектов, рекомендуют ^{разделить суточную дозу на несколько приёмов (не более 2 г за раз) и употреблять бета-аланин вместе с пищей.}

Также советуют попробовать добавку в форме таблеток с медленным усвоением. Они не только предотвращают ^{парестезию при приёме 1,6 г за один раз, но и снижают вывод бета-аланина с мочой на 70%.}

Как принимать бета-аланин

В инструкциях к порошку или таблеткам с бета-аланином указывают рекомендуемую дозу. Как правило, она составляет 3,2 г аминокислоты в день.

В целом, для увеличения показателей рекомендуют ^{потреблять 4–6 г добавки и делать это регулярно на протяжении минимум двух недель, но лучше больше.}

Уровень L-карнозина в мышцах не поднимется мгновенно. Поэтому чем дольше вы пьёте бета-аланин, тем больше будет эффект.

Например, две недели приёма бета-аланина в дозе 1,6 г в день увеличивают ^{содержание мышечного карнозина всего на 8–11%, а 4 недели по 6,4 г добавки в день поднимают его уже на 64%.}

В первый месяц приёма количество L-карнозина увеличивается быстро, потом замедляется, но не останавливается совсем. Так, в одном исследовании ^{18 недель приёма бета-аланина по 6,4 г в день увеличили уровень дипептида на 119%.}

Выводится L-карнозин так же медленно, как и растёт, — и это хорошо. Через три недели после прекращения приёма уровень карнозина снижается ^{на 30%, а к базовому показателю возвращается только через 9 недель.}

Таким образом, вы можете пить его курсами с большими перерывами и не переживать за свою силовую выносливость.

Читайте также 🧐

Аланин — обзор | Темы ScienceDirect

2.2 Определение нормы в клинической практике: случай обычного анализа крови печени

Аланинаминотранфераза (АЛТ) — это обычно назначаемый анализ крови, используемый в качестве маркера воспаления и / или повреждения печени. В средней общественной больнице ее можно было бы измерять на десятках стационарных пациентов в день, и намного больше — в амбулаторных условиях. АЛТ неспецифичен для печени и может быть ненормальным (повышенным) при болезненных состояниях, которые вообще не затрагивают этот орган.На протяжении многих лет были предложены многообещающие анализы дыхания, которые также могут измерять воспаление печени. Может быть, здесь есть важная возможность?

Нормальные диапазоны АЛТ, как и в других анализах крови, были определены много лет назад с использованием предположительно «здоровой» эталонной популяции, часто доноров крови или других крупных баз данных. Обычно это включало оценку сотен, если не многих тысяч образцов. Обычно «ненормальное» просто определяется как плюс два стандартных отклонения. Однако верхний предел нормы (ULN) остается спорным; по состоянию на апрель 2011 г.Luke’s Hospital в Вифлееме, штат Пенсильвания, США, ULN составляет 65 МЕ / л. Однако крупные коммерческие поставщики LabCorp и Quest Diagnostics определяют ULN как 55 и 40 МЕ / л соответственно. Однако признано, что многие из тех, кого считали «здоровыми», могли иметь серьезные недиагностированные серьезные заболевания печени, особенно гепатит С и ожирение печени (например, анализ крови на гепатит С был недоступен, когда были проведены многие из этих исследований, и население в то время не страдали ожирением).Более того, эти диапазоны часто не учитывают возраст, пол, расу и физиологические условия, такие как беременность, которые, как известно, влияют на АЛТ. ¹ Более поздний анализ, проведенный при поддержке Американской ассоциации заболеваний печени (AASLD), подтверждает новый верхний предел 30 МЕ / л для мужчин и 19 МЕ / л для женщин. ² Что еще более важно, даже если вышеупомянутые вопросы решены с ясностью, редко можно быть уверенным, что только потому, что у пациента аномальный АЛТ, у него есть заболевание (печени), и обратное также верно.Эти проблемы встречаются в медицине повсеместно; докторам поручено интерпретировать данные в контексте, который требует опыта и знаний биологии.

Аланин — обзор | Темы ScienceDirect

Функция

Синтез белка: Ala является составной частью практически всех белков и пептидов, синтезируемых в организме. Аланин-тРНК-лигаза (EC6.1.1.7) загружает Ala на конкретную т-РНК в АТФ / магний-зависимой реакции.

Энергетическое топливо: Пируват, выделяющийся при трансаминировании Ala, может быть полностью окислен как энергетическое топливо с образованием 3.425 ккал / г (May and Hill, 1990). Необходимые реакции зависят от тиамина, рибофлавина, ниацина, витамина B6, пантотената, липоата, убихинона, железа и магния.

Глюкозо-аланиновый цикл: Большая часть свободного Ala из мышц экспортируется в кровоток. В печени аминогруппа используется для синтеза мочевины, а остаточный пируват используется для глюконеогенеза путем преобразования в оксалоацетат (пируваткарбоксилаза; EC6.4.1.1) и фосфоенолпируват (фосфоенолпируваткарбоксилаза; EC4.1.1.31). Реакции, участвующие в синтезе глюкозы из пирувата, зависят от ниацина, биотина и магния (см. Пируват в главе 7). Цикл завершается, когда глюкоза возвращается в мышцы, метаболизируется до пирувата и трансаминируется в Ala. Глюкозо-аланиновый цикл облегчает утилизацию мышечных аминокислот в печени во время голодания, голодания и травматического стресса. На Ala приходится более четверти всех аминокислот, поступающих в печень из кровообращения.

Синтез гема: Аминолевулинатаминотрансфераза (EC2.6.1.43, PLP-зависимый) синтезирует предшественник гема дельта-аминолевулинат путем переноса аминогруппы с Ala на 4,5-диоксовалерат. Было высказано предположение, что этот домашний фермент обеспечивает минимальный уровень 5-аминолевулиновой кислоты в дополнение к более вариабельным и регулируемым количествам, продуцируемым аминолевулинатсинтазой.

Другие соединения азота: Аминогруппа Ala может быть использована для синтеза других аминокислот или любого из множества других соединений азота.

Метаболизм глиоксилата: Перенос аминогруппы с Ala на глиоксилат с помощью аланин-глиоксилат аминотрансферазы (EC2.6.1.44, PLP-зависимый) в пероксисомах печени имеет решающее значение для превращения этого метаболита в глицин. Альтернативная судьба глиоксалата — неферментативное превращение в тупиковый метаболит оксалат.

Молекула аланина

Изображение выше: CPK (модель, заполненная космосом) молекулы аланина

Аланин (сокращенно Ala или A; кодируется кодонами GCU, GCC, GCA и GCG) представляет собой α-аминокислоту, которая используется в биосинтезе белков.Он содержит α-аминогруппу (которая находится в протонированной форме -Nh4 + в биологических условиях), группу α-карбоновой кислоты (которая находится в депротонированной форме -COO- в биологических условиях) и метильную группу боковой цепи, классифицирующую это как неполярная (при физиологическом pH) алифатическая аминокислота. Для человека это несущественно, то есть организм может его синтезировать.

Для Трехмерная структура молекулы аланина с использованием Jsmol Щелкните здесь

Символ: Ala A
Молекулярный вес: 89.09
Изоэлектрическая точка (pH) 6,0
Молекулярная формула: C ₃ H ₇ NO ₂

Аланин — одна из 20 наиболее распространенных природных аминокислот. кислоты. Он гидрофобен, с боковой цепью метильной группы, и является вторым по величине из 20 после глицина.

α-атом углерода молекулы аланина связан с метильной группой (-Ch4), что делает его одной из простейших α-аминокислот, а также приводит к классификации аланина как алифатической аминокислоты.Метильная группа аланина нереактивна и, таким образом, почти никогда напрямую не участвует в функции белка.

Аланин представляет собой молекулу аминокислоты, которая не может быть фосфорилирована, что делает ее весьма полезной в эксперименте по потере функции в отношении фосфорилирования.

Аланин — незаменимая аминокислота, участвует в метаболизме триптофана и витамин пиридоксин. Это один из самых распространенных использованные аминокислоты в построении белка, усреднение около 9 процентов от среднего белкового состава.Аланин содержится в жидкости предстательной железы и может играть важная роль в здоровье простаты. Источники аланин — это мясо, птица, яйца, молочные продукты, и рыбу.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Парадокс неправильного перевода серина на аланин, вызванный дилеммой распознавания AlaRS

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Конформационная энтропия аланина по сравнению с глицином в денатурированных состояниях белка

Реферат

Наличие остатка аланина, подвергающегося воздействию растворителя, стабилизирует спираль на 0,4–2 ккал · моль ^–1 относительно глицина.Различные факторы были предложены для объяснения различий в склонности к спирали, от более высокой конформационной свободы последовательностей глицина в развернутом состоянии до гидрофобной и ван-дер-ваальсовой стабилизации боковой цепи аланина в спиральном состоянии. Мы выполнили моделирование молекулярной динамики всех атомов с явным растворителем и исчерпывающей выборкой модельных пептидов, чтобы решить проблему конформационной энтропии основной цепи между Ala и Gly в денатурированном состоянии. Мутация Ala в Gly приводит к увеличению конформационной энтропии, эквивалентной ≈0.4 ккал · моль ^-1 в полностью гибком денатурированном, то есть в развернутом, состоянии. Но эта энергия уравновешивается (измеренной) разницей в свободной энергии переноса боковых цепей глицина и аланина из паровой фазы в воду, так что развернутые аланин- и глицинсодержащие пептиды являются приблизительно изоэнергетическими. Склонность Ala к стабилизации спирали по сравнению с Gly, таким образом, в основном является результатом более благоприятных взаимодействий Ala в складчатой ​​спиральной структуре. Небольшая разница в энергетике денатурированных состояний означает, что значения Φ, полученные в результате сканирования спиралей Ala → Gly, являются очень хорошей мерой степени формирования структуры в белках с небольшой остаточной структурой в денатурированном состоянии.

Было проведено много экспериментальных и теоретических исследований относительной склонности аминокислот к образованию спиралей (1–9) с тех пор, как структура α-спирали была предсказана Полингом и соавторами в 1951 году (10). Независимо от методов оценки, Ala неизменно имеет высокую склонность к образованию спирали, а Gly и Pro — самую низкую. Склонность Ala к спирали относительно Gly, однако, значительно различается в разных исследованиях. Приведенные значения включают ≈0,9 ккал · моль ^–1 из исследований, в которых мутации были сделаны в позициях, подверженных воздействию растворителя, в спирали белка (3, 6), тогда как значения варьируются от ≈0.От 7 до 2,0 ккал · моль ^-1 в пептидах (2, 7, 9). В белках величина изменения свободной энергии при мутации Ala в Gly во внутреннем положении α-спирали обычно составляет от 0,4 до 2,0 ккал / моль (4).

Происхождение разницы в наклонности спирали между Ala и Gly также является предметом некоторых дискуссий. Факторы, которые считаются важными, включают разницу в конформационной энтропии основной цепи в денатурированном состоянии, захоронение гидрофобных поверхностей при сворачивании и разрушение водородных связей между белком и растворителем (4, 6, 11-19).Предполагаемая относительная важность способствующих факторов также изменяется в зависимости от используемого метода или системы, в которой они были измерены. Один из самых ранних расчетов, проведенных Личем и Шерагой, оценил разницу в вкладе основной цепи в энтропию разворачивания между Ala и Gly как -2,4 кал · моль ^-1 · K ^-1 , исходя из исключенного объема из-за стерические взаимодействия (11). Очень похожее значение было получено Freire и соавторами (14) в мутационном исследовании с использованием области лейциновой молнии GCN4.Напротив, другие исследования получили гораздо меньшую разницу в конформационной энтропии скелета (17, 18).

Здесь мы используем всеатомное моделирование молекулярной динамики с явным растворителем для оценки разницы конформационной энтропии основной цепи между Ala и Gly в денатурированном состоянии. Мы используем несколько различных моделей денатурированного состояния. Небольшие пептиды используются в качестве моделей денатурированного состояния с минимальным влиянием остальной части белка: AXA и GGXGG, где X — это либо Ala, либо Gly.Мы также используем моделирование высокотемпературного разворачивания, выполненное в рамках проекта dynameomics (www.dynameomics.org) (20), для моделирования денатурированных состояний интактных белков. Результаты имеют прямое значение для интерпретации значений Φ для сворачивания белка, полученных в результате сканирования спиралей Ala → Gly, посредством чего изменения свободной энергии активации сворачивания при мутации аланина в глицин сравниваются с соответствующими изменениями свободной энергии денатурация, чтобы сделать вывод о степени формирования структуры в переходном состоянии сворачивания (21, 22) (рис.1).

Термодинамические циклы в мутагенезе, связывающие измерения белков дикого типа и мутантных белков с рассчитанными энергиями изменений в структуре при мутации («алхимические» термины). Экспериментально измеряемые параметры: Δ G _D-N , свободная энергия для денатурации белка дикого типа, и Δ G _{D’-N ‘}, энергия мутанта; Δ G _TS-N , свободная энергия активации разворачивания белка дикого типа, и Δ G _{TS’-N ‘}, энергия мутанта; и Δ G _TS-D , свободная энергия активации сворачивания белка дикого типа, и Δ G _{TS’-D ‘}, энергия мутанта.Изменения наблюдаемых связаны с изменениями «алхимических» терминов следующим образом: ΔΔ G _DN = Δ G _{D′-N ′} — Δ G _DN = Δ G _D′-D — Δ G _N′-N ; ΔΔ G _TS-N = Δ G _{TS′-N ′} — Δ G _TS-N = Δ G _TS′-TS — Δ G _{N ′ -N} ; и ΔΔ G _TS-D = Δ G _{TS′-D ′} — Δ G _TS-D = Δ G _TS′-TS — Δ G _{D ′ -D} .Изменения ковалентных энергий в алхимии нейтрализуются. Эта цифра изменена из исх. 33. Расчет Φ-значений из свободных энергий приведен в уравнениях. 1 и 2 .

Результаты

Пептидные модели денатурированного состояния.

Мы использовали две пептидные системы, AXA и GGXGG, для моделирования минимально затрудненного денатурированного состояния, подобного статистическому клубку, где X представляет собой либо Ala, либо Gly. Один из важных вопросов в этом типе исследования заключается в том, проводилось ли моделирование достаточно долго для достижения достаточной выборки конформационного пространства.Чтобы решить эту проблему, мы измерили покрытие конформационного пространства через регулярные промежутки времени на протяжении 298 K моделирования (рис. 2). Покрытие оценивалось как процент заполненных (Φ, Ψ) ячеек. После быстрого увеличения охвата наблюдался все более медленный рост, так что к 50 нс времени моделирования ≈90% бинов, заполненных после 100 нс моделирования, уже были заполнены. При 75 нс этот процент увеличился до ≈95%. Эти результаты говорят о том, что у нас действительно была адекватная выборка; расширение моделирования приведет к небольшому увеличению охвата за счет большого количества времени вычислений.

Покрытие Φ-пространства сходится во времени моделирования. ( a ) Пептиды AXA. ( b ) Пептиды GGXGG. Процентное покрытие пространства Φ-показано с интервалами 5 нс в течение 100 нс моделирования. В этих расчетах использовался размер ячейки 5 ° × 5 °.

Еще одно соображение заключается в том, что наш расчет энтропии может зависеть от размера ячеек, используемых при подразделении пространства (Φ, Ψ). Но, как показано для моделирования пептида 298-K GGXGG, различия энтропии мало менялись в зависимости от размера ячейки (таблица 1).В этом случае среднее значение T Δ S (A → G) при 298 K составило -0,342 ккал · моль ^-1 со стандартным отклонением 0,006 ккал · моль ^-1 .

Конформационная энтропия основной цепи для Ala и Gly

Разница конформационной энтропии основной цепи между Ala и Gly в обеих пептидных моделях показана в таблице 1. Распределения (Φ, Ψ) для пептидов GGAGG и AAA, а также пептидов GGGGG и AGA были очень похожи (рис. 3), что отражено. аналогичными различиями конформационной энтропии основной цепи при 298 К.Значение для пептидов GGXGG было в ≈1,2 раза больше, чем для пептидов AGA, при этом оба значения были <0,5 ккал · моль ^-1 . Мы использовали высокотемпературную модель развернутого состояния, чтобы оценить разницу конформационной энтропии основной цепи между Ala и Gly в спиралях. Поэтому полезно определить, как высокая температура изменяет распределение (Φ, Ψ) более мелких пептидов. В моделировании GGXGG 498K и Ala, и Gly имели больший охват (Φ, Ψ) пространства, чем моделирование при 298 K.GGAGG заполнял 68% интервалов при 498 K и 51% при 298 K, тогда как GGGGG заполнял 82% и 76% интервалов при 498 K и 298 K соответственно. Распределение (Φ, Ψ) также несколько изменялось с температурой (рис. 3). Изменение было более заметным для пептида GGGGG, где популяции верхнего правого и нижнего левого квадрантов были уменьшены, а популяции верхнего левого и нижнего правого квадрантов увеличивались при высокой температуре. Это изменение в распределении привело к увеличению конформационной энтропии ( S = −Σ p _i ln p _i ) как для Ala, так и для Gly.Однако Δ (−Σ p _i ln p _i ) (A → G) было одинаковым в обоих случаях, составляя 0,6 как при 298, так и при 498 K. Если распределение, наблюдаемое при 498 K, подходило для использования в качестве модели для развернутого состояния при 298 K, это даст значение для T Δ S (A → G) при 298 K, равное −0,4 ккал · моль ⁻¹ , аналогично тому, которое наблюдается для Пептиды GGXGG при 298 К (-0,3 ккал · моль ^-1 ).

графиков Рамачандрана для пептидных моделей денатурированного состояния, подобного случайному клубку: AAA, AGA, GGAGG и GGGGG при 298 К и GGAGG и GGGGG при 498 К.График Рамачандрана разделен на ячейки 5 ° × 5 ° и окрашен в соответствии с населением каждой ячейки. Всего было подсчитано 100 000 конформаций за 100 нс моделирования. Основные конформации репрезентативных структур показаны рядом с графиками 298K. Центральный остаток (для которого были вычислены углы Φ и) отмечен звездочкой.

Динамеомика: полноразмерные белковые модели денатурированного состояния.

Маленькие пептиды являются подходящими моделями для областей случайных клубков денатурированных состояний.Первоначально мы попытались смоделировать эффекты мутаций A → G в структурированных областях денатурированных состояний, используя изолированные спирали из барназы и заращенного гомеодомена. Однако время моделирования 300 нс привело к недостаточной выборке. Чтобы избежать неадекватной выборки, мы использовали данные из нашей базы данных dynameomics, в которой в качестве исходных целей моделируются естественные и разворачивающиеся траектории для представителей всех белковых складок из списка из 1130 неизбыточных складок (www.dynameomics.org) (20). Из 145 проанализированных в настоящее время белков 114 покинули нативный и первые промежуточные кластеры (если они есть) за 10 нс времени моделирования при 498 К (см. методы ). База данных из 114 белков содержит огромное количество данных, которые можно сравнить с нашими небольшими моделями пептидов.

Мы рассчитали разницу конформационной энтропии остова между Ala и Gly в спиралях на основе данных динамеомики. Сначала были идентифицированы остатки Ala и Gly, которые занимали центральное положение на участке спиральной структуры из трех остатков в исходной структуре 114 белков-мишеней.Согласно этому определению, 386 остатков Ala и 110 Gly приняли спиральную конформацию в исходной структуре. Было необходимо уменьшить количество отобранных остатков Ala, чтобы оно было таким же, как количество остатков глицина: во-первых, остатки отбирали на основе последовательности фланкирующих аминокислот; а во втором случае остатки классифицировались по количеству времени, проведенному в непрерывной спиральной структуре в денатурированном состоянии, и путем оценки влияния остаточной структуры на разность энтропии.

Энтропия рассчитана на основе сопоставления последовательностей.

Для каждого из 110 остатков Gly, которые были спиральными в нативном состоянии, из набора данных из 386 остатков Ala был выбран Ala с одинаковыми фланкирующими ( i — 1 и i + 1) аминокислотами. Такой отбор остатков обеспечивал сравнение одного и того же количества образцов, а также в некоторой степени компенсировал различия в последовательностях между белками. Не удалось найти совпадения для всех остатков Gly, что привело к размеру выборки 78 остатков.Графики Рамачандрана для выбранных остатков как при 298, так и при 498 K показаны на рис. 4. Как и ожидалось, при 298 K остатки Ala и Gly, происходящие из спиральной структуры, оставались в преимущественно спиральной конформации с низкой популяцией за пределами наиболее предпочтительной спиральной области. . При 498 K распределение (Φ, Ψ) становится более похожим на распределение соответствующего пептида GGXGG (рис. 3 и 4). Однако, в частности, для Ala данные динамеомики имели более высокую заселенность спиральной области, чем GGXGG при той же температуре.Наблюдалась заметная разница между значениями −Σ p _i ln p _i в наборах данных 298 и 498 K (Таблица 1). Например, в нативном состоянии (298 K траекторий) значение −Σ p _i ln p _i для Ala составляло 4,5, тогда как в высокотемпературном денатурированном состоянии — 7,1. Однако значения Δ (−Σ p _i ln p _i ) (A → G) были одинаковыми: −0,5 в исходном состоянии и −0.7 в высокотемпературном денатурированном состоянии. Для нативного состояния это дало разницу конформационной энтропии основной цепи между Ala и Gly примерно -0,3 ккал · моль ^-1 . Предположение, что конформации, наблюдаемые при 498 K, представляют денатурированный ансамбль при 298 K, даст значение для T Δ S (A → G) примерно -0,4 ккал · моль ^-1 . Мы ожидаем, что значение, рассчитанное с использованием этого предположения, занижает значение, рассчитанное с истинным денатурированным ансамблем 298 К.

графиков Рамачандрана для остатков Ala и Gly, начинающихся в спиральной конформации в наборе данных динамеомики. ( Верхний левый ) Ala при 298 K. ( Верхний правый ) Gly при 298 K. ( Нижний левый ) Ala при 498 K. ( Нижний правый ) Gly при 498 K. График Рамачандрана разделен на Ячейки 5 ° × 5 ° и окрашены в соответствии с количеством отсчетов в каждой ячейке. В каждом случае было взято 1 716 000 проб из 78 остатков. На этом рисунке данные были сокращены до 100000 образцов, чтобы облегчить сравнение с небольшими пептидами (рис.3). Поскольку Ala представлен в базе данных лучше, чем Gly, не все остатки Ala были использованы для этого расчета. Вместо этого для каждого остатка Gly был выбран Ala с одинаковыми фланкирующими ( i — 1 и i + 1) аминокислотами из большего набора данных.

Остатки, классифицированные по количеству спиральной структуры в денатурированном состоянии.

Процент времени, в течение которого спиральная конформация принималась в денатурированном состоянии, был рассчитан для каждого из остатков 110 Gly и 386 Ala.Вычет считался спиральным, если он был одним из трех смежных вычетов со спиральными (Φ, Ψ) углами. Расчет проводился между 10 и 21 нс на траекториях 498 K (см. методы ). Затем остатки были разделены на четыре категории в соответствии с процентной долей времени, когда была принята спиральная структура (0–20%, 20–40%, 40–60% и 60–100% времени в спиральной конформации). Доля остатков, принимающих спиральные конформации для <20% денатурированного состояния, была выше для Gly (61% остатков), чем для Ala (38% остатков).Значение −Σ p _i ln p _i было рассчитано для каждой категории для Ala и для остатков со спиральной структурой 0–20% для Gly (слишком мало остатков Gly присутствовало в других категориях). Размер выборки составлял 65 остатков в каждом случае, что соответствует количеству остатков Gly со спиральной структурой 0–20% (таблица 1). Эти данные можно использовать для оценки изменения разницы энтропии между Ala и Gly в спирали в зависимости от количества структуры в денатурированном состоянии.Если остатки Ala и Gly имеют спиральную структуру 0–20%, Δ (−Σ p _i ln p _i ) (A → G) составляет -0,6, что очень похоже на значение — 0,7 видно, когда остатки были выбраны путем сопоставления последовательностей. При 298 К это даст значение TΔS (A → G) примерно -0,3 ккал · моль ^-1 .

При оценке влияния остаточной спиральной структуры на конформационную разницу энтропии мы сравнивали каждый набор данных Ala с остатками Gly, имеющими спиральную структуру 0–20% в денатурированном состоянии.Это представляет случай, когда мутация Ala в Gly приводит к значительному уменьшению остаточной спиральной структуры и, таким образом, дает верхний предел размера разницы конформационной энтропии между Ala и Gly для каждой категории. Как и ожидалось, конформационная разница энтропии между остатками Ala и Gly значительно увеличивалась по мере увеличения процента времени, в течение которого остатки Ala принимают спиральную структуру в денатурированном состоянии (Таблица 1). Наибольшее значение Δ (−Σ p _i ln p _i ) (A → G) равно −2.5 при 298 К, ​​что дает значение T ΔS (A → G), равное -1,5 ккал · моль ^-1 .

Экспериментальные данные по изменению свободной энергии при мутациях Ala → Gly.

Мы смоделировали мутацию Ala в Gly в сайтах в середине спиралей, которые подвергаются действию растворителя и не вовлекают участие доноров или акцепторов неспаренных водородных связей для репрезентативных белков. Мы построили график (рис. 5) экспериментально измеренных изменений свободной энергии денатурации в сравнении с рассчитанными изменениями доступной для растворителя площади неполярной поверхности для B-домена белка A (22), барназы (4, 5), Im9 (23), ACBP (24), CI2 (25) и R16 (26).Эти данные совпадают с данными более ранних исследований барназа с хорошей корреляцией между изменениями свободной энергии в стабильности и площадью поверхности нативного состояния, с наклоном ≈35 кал Å ^-2 , показывая, что захоронение растворителя — доступная площадь поверхности метильной группы аланина в нативном состоянии является доминирующим фактором в общей энергетике.

График изменения свободной энергии денатурации репрезентативных белков при мутации A в G в зависимости от изменения доступной для растворителя неполярной площади поверхности для открытых для растворителя участков в середине спиралей.

Обсуждение

Мы подсчитали, что присутствие глицина в простых развернутых пептидах вносит благоприятный конформационный энтропийный эквивалент приблизительно -0,3-0,4 ккал · моль ^-1 к свободной энергии при 298 К (= — T Δ S ), относительно наличия аланина. Мы оценили такой же вклад для областей белков, которые не имеют значительной остаточной структуры в денатурированном состоянии. Эта разница в энергии мала и явно не учитывает наблюдаемую стабилизацию спиралей Ala относительно Gly до 2 ккал · моль ^-1 .Действительно, корреляция между энергией стабилизации, вносимой мутацией Gly в Ala, и изменением доступной для растворителя поверхности нативной спирали (4, 5) (рис. 5) убедительно свидетельствует о том, что взаимодействия аланина в свернутой спирали играют доминирующую роль. роль в стабилизации спиралей.

В областях белков, которые имеют остаточную структуру в денатурированном состоянии, конформационная энтропия глицина по сравнению с аланином составляет 1,5 ккал · моль ^-1 свободной энергии. Это произошло из-за структуры, индуцированной аланином.Таким образом, с точки зрения общей свободной энергии денатурированного состояния взаимодействия боковой цепи аланина с другими боковыми цепями в структурированных денатурированных областях должны вносить вклад в энтальпийный член, который уравновешивает потерю свободной энергии конформации.

Приведенные выше результаты представляют интерес сами по себе, но они очень важны для анализа значений Φ. В исследованиях сворачивания белков сканирование Ala → Gly является важным инструментом для исследования структуры переходного состояния сворачивания (TS) (21, 22).В частности, этот метод обычно используется для определения степени формирования структуры в открытых для растворителя позициях α-спиралей. Степень структуры в TS количественно определяется значением Φ, рассчитанным на основе измеренных данных равновесия и кинетики денатурации белков дикого типа и мутантных белков (рис. 1, где мутант обозначен штрихом) (27–30) . Значение Φ для складывания определяется как Что касается других изменений циклов на рис.1, В случае полного формирования локальной структуры в переходном состоянии Δ G _TS′-TS = Δ G _N′-N , а Φ = 1.Если локальная структура в переходном состоянии такая же денатурированная, как и в денатурированном состоянии, Δ G _TS′-TS = Δ G _D′-D и Φ = 0. Δ G _{D ′ -D} член в уравнении. 2 вносит вклад в нелинейную зависимость Φ от степени образования структуры между крайними значениями 0 и 1. Соответственно, значения Φ отличаются от α классических соотношений равновесия скорости и свободной энергии (31).

Значение Δ G _D′-D можно рассматривать как сумму двух составляющих Δ G _{reorg (D′-D)} и Δ G _{solv (D′-D)} (28).Δ G _{reorg (D’-D)} — это изменение энергии денатурированного состояния, когда оно претерпевает реорганизацию структуры при мутации, а Δ G _{solv (D′-D)} — соответствующее изменение в свободная энергия сольватации. В некоторых случаях, таких как мутация более крупных алифатических боковых цепей в более мелкие, когда в денатурированном состоянии нет остаточной структуры, Δ G _D’-D близка к нулю, как измерено по изменению свободной энергии. перехода из газовой фазы в воду (30).Величина Δ G _{solv (D’-D)} обычно составляет <0,2 ккал · моль ^-1 для этих остатков (32). В таких случаях Φ ∼ Δ G _TS′-TS / Δ G _N′-N , что, в свою очередь, может быть хорошей мерой количества гидрофобных взаимодействий, произведенных в TS относительно N. По этой причине гидрофобные мутации от больших к меньшим размерам были предпочтительными для анализа значения Φ (30, 33). Это соотношение также является основой для широко используемого расчета значений Φ на основе моделирования (34–36).Для Ala в Gly Δ G _{solv (D’-D)} составляет 0,45 ккал · моль ^-1 (32), более благоприятная энергия сольватации боковой цепи аланина почти точно компенсирует более низкую конформационную свободную энергию. в полностью разложенном состоянии. Таким образом, Δ G _D’-D приблизительно равно нулю для мутаций Ala → Gly, где нет остаточной структуры в денатурированном состоянии. В этом случае Φ ∼ Δ G _TS’-TS / Δ G _N’-N, как для мутаций с гидрофобной делецией.Таким образом, сканирование Ala → Gly является исключительно хорошим датчиком для определения значения Φ.

Методы

Моделирование пептидов.

AXA и GGXGG были смоделированы с использованием в молекулярной механике lucem ( и мм) (37) с несвязанным отсечением с силовым смещением 8 Å и несвязанным циклом обновления 3. Пептиды ацетилировали по N-концу. и амидирован на конце C. Все атомы растворенного вещества и окружающей воды явно присутствовали, и силовые поля Levitt et al. (38, 39). Моделирование проводилось для 101 нс при 298 К (AXA и GGXGG) и 498 К (только GGXGG). Структуры сохранялись с интервалом в 1 пс. Первые 1 нс каждого моделирования были исключены из анализа, чтобы учесть тепловое уравновешивание системы.

Протокол динамеомики.

Проект dynameomics (www.dynameomics.org) направлен на моделирование репрезентативных членов всех белковых складок в нативных и денатурирующих условиях (20). Собственные траектории были смоделированы при 298 К в течение 21 нс в и мм с использованием несвязанного отсечки с силовым смещением 10 Å и несвязанного цикла обновления из 3; структуры сохранялись для анализа с интервалом в 1 пс.Повторяющиеся траектории развертывания моделировались при 498 K в течение 21 нс каждая, также с использованием или мм. Использовали отсечку без скрепления с силовым смещением на 8 Å и цикл обновления без скрепления, равный 3, и структуры сохраняли для анализа с интервалами в 1 пс.

Было проанализировано двадцать наносекунд каждой траектории 298-K dynameomics. Были проанализированы только последние 10 нс из 498-K dynameomics траекторий, что дало одинаковое количество выборок как при 298, так и при 498 K. Здесь было рассмотрено 145 целей.Время моделирования 20 нс было недостаточным для того, чтобы ряд более крупных белков развернулся в какой-либо степени. Сравнение с более ранними, хорошо охарактеризованными и экспериментально подтвержденными моделями из нашей лаборатории показывает, что белки с ВРОЖДЕННОЙ структурной несходственностью (40) баллом> 0,5 покинули как нативный, так и первый промежуточный (если есть) кластеры (41–44). Поэтому белки, у которых показатель CONGENEAL оставался <0,5, были исключены. Показатель CONGENEAL несходства, введенный Йи и Диллом (40), определен для сравнения двух структур с таким же количеством остатков, что и Для двух структур R и S , r _ij — это расстояние между атомами i и j в структуре R , а s _ij — расстояние в структуре S . .Эти расстояния возведены в степень — p , где p = 2 в данном случае. Оценка CONGENEAL — это мера несходства, при которой больше внимания уделяется ближайшим соседям, чем остаткам, находящимся далеко друг от друга в последовательности. По сравнению со среднеквадратичным отклонением C ^α , в балле ВРОЖДЕННЫЙ в меньшей степени преобладает движение твердого тела.

Расчеты энтропии.

Энтропия была рассчитана для конформаций скелета из распределения углов (Φ, Ψ) как S = — R Σ [ p _i ln ( p _i )], где p _i — это дробное заполнение ячейки i .Чтобы проверить, зависят ли наши результаты от деления пространства (Φ, Ψ), энтропия была рассчитана с использованием интервалов 2 × 2, 3 × 3, 5 × 5 и 10 × 10 ° для пептидов GGAGG и GGGGG. Было показано, что разница энтропии не зависит от размера ячейки, и для всех других систем использовался размер ячейки 5 × 5 °.

Расчет изменений доступной для растворителя площади поверхности при мутации Ala в Gly в белках.

Мутации Ala в Gly были смоделированы с использованием Swiss-PdbViewer (45) для репрезентативных белков [домен B белка A (запись PDB 1SS1), барназа (1A2P), Im9 (1IMQ), ACBP (1NT1), C12 (2CI2). ) и R16 (1CUN)].Изменения доступной для растворителя площади поверхности рассчитывали с использованием программы NACCESS (С. Дж. Хаббард и Дж. М. Торнтон, Университетский колледж Лондона).

Благодарности

Вычислительная работа была поддержана грантом GM 50789 Национального института здравоохранения (В.Д.).

Сноски

• Вклад авторов: K.