Атф вырабатывается. Строение и функции атф. Энергетика мышечной деятельности
Аденозинтрифосфорная кислота – АТФ
Нуклеотиды являются структурной основой для целого ряда важных для жизнедеятельности органических веществ, например, макроэргических соединений.
Универсальным источником энергии во всех клетках служит АТФ — аденозинтрифосфорная кислота или аденозинтрифосфат.
АТФ
содержится в цитоплазме, митохондриях, пластидах и ядрах клеток и является наиболее распространенным и универсальным источником энергии для большинства биохимических реакций, протекающих в клетке.
АТФ
обеспечивает энергией все функции клетки: механическую работу, биосинтез веществ, деление и т.д. В среднем содержание АТФ в клетке составляет около 0,05% её массы, но в тех клетках, где затраты АТФ велики (например, в клетках печени, поперечно полосатых мышц), её содержание может доходить до 0,5%.
Строение АТФ
АТФ представляет собой нуклеотид, состоящий из азотистого основания — аденина, углевода рибозы и трёх остатков фосфорной кислоты, в двух из которых запасается большое количество энергии.
Связь между остатками фосфорной кислоты называют макроэргической (она обозначается символом ~ ), так как при ее разрыве выделяется почти в 4 раза больше энергии, чем при расщеплении других химических связей.
АТФ — неустойчивая структура и при отделении одного остатка фосфорной кислоты, АТФ переходит в аденозиндифосфат (АДФ) высвобождая 40 кДж энергии.
Другие производные нуклеотидов
Особую группу производных нуклеотидов составляют переносчики водорода. Молекулярный и атомарный водород обладает большой химической активностью и выделяется или поглощается в ходе различных биохимических процессов. Одним из наиболее широко распространенных переносчиков водорода является никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ).
Молекула НАДФ способна присоединять два атома или одну молекулу свободного водорода, переходя в восстановленную форму НАДФ · H 2 . В таком виде водород может быть использован в различных биохимических реакциях.
Витамины
Витамины (от лат. vita — жизнь) — сложные биоорганические соединения, совершенно необходимые в малых количествах для нормальной жизнедеятельности живых организмов. От других органических веществ витамины отличаются тем, что не используются в качестве источника энергии или строительного материала. Некоторые витамины организмы могут синтезировать сами (например, бактерии способны синтезировать практически все витамины), другие витамины поступают в организм с пищей.
Витамины принято обозначать буквами латинского алфавита. В основу современной классификации витаминов положена их способность растворяться в воде и жирах (они делятся на две группы: водорастворимые (B 1 , B 2 , B 5 , B 6 , B 12 , PP , C) и жирорастворимые (A , D , E , K)).
Витамины участвуют практически во всех биохимических и физиологических процессах, составляющих в совокупности обмен веществ. Как недостаток, так и избыток витаминов может привести к серьезным нарушениям многих физиологических функций в организме.
Бесспорно, самой важной молекулой в нашем организме с точки зрения производства энергии является АТФ (аденозинтрифосфат: адениловый нуклеотид, содержащий три остатка фосфорной кислоты и образуемый в митохондриях).
В действительности, каждая клетка нашего организма сохраняет и использует энергию для биохимических реакций посредством АТФ, таким образом, АТФ может считаться универсальной валютой биологической энергии. Все живые существа нуждаются в непрерывном энергоснабжении для поддержки синтеза белка и ДНК, метаболизма и транспорта различных ионов и молекул, поддержания жизнедеятельности организма. Мышечные волокна в ходе силовых тренировок также требуют легкодоступной энергии. Как уже упоминалось, энергию для всех этих процессов поставляет АТФ. Однако для того, чтобы сформировать АТФ, нашим клеткам требуется сырье. Люди получают это сырье через калории посредством окисления потребляемой пищи. Для получения энергии, эта пища сначала должна быть переработана в легко используемую молекулу – АТФ.
Перед использованием молекула АТФ должна пройти через несколько фаз.
Сначала при помощи специального коэнзима отделяется один из трех фосфатов (каждый из которых содержит десять калорий энергии), благодаря чему высвобождается большое количество энергии и формируется продукт реакции аденозиндифосфат (АДФ). Если требуется больше энергии, то отделяется следующая фосфатная группа, формируя аденозинмонофосфат (АМФ).
АТФ + H 2 O → АДФ + H 3 PO 4 + энергия
АТФ + H 2 O → АМФ + H 4 P 2 O 7 + энергия
Когда быстрого производства энергии не требуется, происходит обратная реакция – при помощи АДФ, фосфагена и гликогена фосфатная группа вновь присоединяется к молекуле, благодаря чему формируется АТФ. Данный процесс включает перенос свободных фосфатов к другим содержащимся в мышцах веществам, к которым относятся и . При этом из запасов гликогена берется и расщепляется глюкоза.
Полученная из этой глюкозы энергия помогает вновь преобразовывать глюкозу в ее первоначальную форму, после чего свободные фосфаты вновь могут быть присоединены к АДФ для формирования нового АТФ. После завершения цикла вновь созданный АТФ готов к следующему использованию.
В сущности АТФ работает как молекулярная батарея, сохраняя энергию, когда она не нужна, и высвобождая в случае необходимости. Действительно, АТФ похож на полностью перезаряжаемую батарею.
Структура АТФ
Молекула АТФ состоит из трех компонентов:
- Рибоза (тот же самый пятиуглеродный сахар, что формирует основу ДНК)
- Аденин (соединенные атомы углерода и азота)
- Трифосфат
Молекула рибозы располагается в центре молекулы АТФ, край которой служит базой для аденозина.
Цепочка из трех фосфатов располагается с другой стороны молекулы рибозы. АТФ насыщает длинные, тонкие волокна, содержащие белок миозин, который формирует основу наших мышечных клеток.
Сохранение АТФ
В организме среднего взрослого человека ежедневно используется около 200-300 молей АТФ (моль – это химический термин, обозначающий количество вещества в системе, в котором содержится столько элементарных частиц, сколько атомов углерода содержится в 0,012 кг изотопа углерод-12). Общее количество АТФ в организме в каждый отдельно взятый момент составляет 0,1 моли. Это означает, что АТФ должен повторно использоваться 2000-3000 раз в течение дня. АТФ не может быть сохранен, поэтому уровень его синтеза почти соответствует уровню потребления.
Системы АТФ
Ввиду важности АТФ с энергетической точки зрения, а также из-за его широкого использования у организма имеется различные способы производства АТФ. Это три разные биохимические системы. Рассмотрим их по порядку:
Когда мышцам предстоит короткий, но интенсивный период активности (около 8-10 секунд), используется фосфагенная система – АТФ соединяется с креатинфосфатом. Фосфагенная система обеспечивает постоянную циркуляцию небольшого количества АТФ в наших мышечных клетках.
Мышечные клетки также содержат высокоэнергетический фосфат – фосфат креатина, который используется для восстановления уровня АТФ после кратковременной, высокоинтенсивной активности. Энзим креатинкиназа отнимает фосфатную группу у креатина фосфата и быстро передает ее АДФ для формирования АТФ. Итак, мышечная клетка превращает АТФ в АДФ, а фосфаген быстро восстанавливает АДФ до АТФ. Уровень креатина фосфата начинает снижаться уже через 10 секунд высокоинтенсивной активности, и уровень энергии падает. Примером работы фосфагенной системы является, например, спринт на 100 метров.
Система гликогена и молочной кислоты снабжает организм энергией в более медленном темпе, чем фосфагенная система, хотя и работает относительно быстро и предоставляет достаточно АТФ примерно для 90 секунд высокоинтенсивной активности. В данной системе молочная кислота образуется из глюкозы в мышечных клетках в результате анаэробного метаболизма.
Учитывая тот факт, что в анаэробном состоянии организм не использует кислород, эта система дает кратковременную энергию без активации кардио-респираторной системы точно так же, как и аэробная система, но с экономией времени. Более того, когда в анаэробном режиме мышцы работают быстро, мощно сокращаются, они перекрывают поступление кислорода, поскольку сосуды оказываются сжатыми.
Эту систему еще иногда называют анаэробным дыханием, и хорошим примером в данном случае послужит 400-метровый спринт.
Если физическая активность длится более дух минут, в работу включается аэробная система, и мышцы получают АТФ сначала из , потом из жиров и наконец из аминокислот (). Белок используется для получения энергии в основном в условиях голода (диеты в некоторых случаях).
При аэробном дыхании производство АТФ проходит наиболее медленно, но энергии получается достаточно, чтобы поддерживать физическую активность на протяжении нескольких часов. Это происходит потому, что при аэробном дыхании глюкоза распадается на диоксид углерода и воду, не испытывая противодействия со стороны молочной кислоты в системе гликогена и молочной кислоты. Гликоген (накапливаемая форма глюкозы) при аэробном дыхании поставляется из трех источников:
- Всасывание глюкозы из пищи в желудочно-кишечном тракте, которая через систему кровообращения попадает в мышцы.
- Остатки глюкозы в мышцах
- Расщепление гликогена печени до глюкозы, которая через систему кровообращения попадает в мышцы.
Заключение
Если вы когда-нибудь задумывались над тем, откуда у нас берется энергия для выполнения разнообразных видов активности при различных условиях, то ответом будет — в основном за счет АТФ. Эта сложная молекула оказывает помощь в преобразовании различных пищевых компонентов в легко используемую энергию.
Без АТФ наш организм просто не смог бы функционировать. Таким образом, роль АТФ в производстве энергии многогранна, но в то же время проста.
Рассказы о биоэнергетике Скулачев Владимир Петрович
Где и как образуется АТФ?
Первой системой, для которой выяснили механизм образования АТФ, оказался гликолиз — вспомогательный тип энергообеспечения, включающийся в условиях нехватки кислорода. При гликолизе молекула глюкозы расщепляется пополам и полученные обломки окисляются до молочной кислоты.
Такое окисление сопряжено с присоединением фосфорной кислоты к каждому из фрагментов молекулы глюкозы, то есть с их фосфорилированием. Последующий перенос фосфатных остатков с фрагментов глюкзы на АДФ дает АТФ.
Механизм образования АТФ при внутриклеточном дыхании и фотосинтезе долгое время оставался совершенно неясным. Было известно только, что ферменты, катализирующие эти процессы, встроены в биологические мембраны — тончайшие пленки (толщиной около одной миллионной доли сантиметра), состоящие из белков и фосфорилированных жироподобных веществ — фосфолипидов.
Мембраны — важнейший структурный компонент любой живой клетки. Внешняя мембрана клетки отделяет протоплазму от окружающей клетку среды. Клеточное ядро окружено двумя мембранами, которые образуют ядерную оболочку — преграду между внутренним содержимым ядра (нуклеоплазмой) и остальной частью клетки (цитоплазмой). Кроме ядра, в клетках животных и растений находят еще несколько структур, окруженных мембранами. Это эндоплазматическая сеть — система мельчайших трубочек и плоских цистерн, стенки которых образованы мембранами. Это, наконец, митохондрии — шарообразные или вытянутые пузырьки размером мельче ядра, но крупнее компонентов эндоплазматической сети. Диаметр митохондрии обычно около микрона, хотя иногда митохондрии образуют ветвящиеся и сетчатые структуры протяженностью в десятки микрон.
В клетках зеленых растений, помимо ядра, эндоплазматической сети и митохондрий, находят еще и хлоропласты — мембранные пузырьки более крупные, чем митохондрии.
Каждая из этих структур выполняет свою, специфическую биологическую функцию. Так, ядро — вместилище ДНК. Здесь происходят процессы, лежащие в основе генетической функции клетки, и начинается сложная цепь процессов, приводящая в конечном итоге к синтезу белка. Этот синтез завершается в мельчайших гранулах — рибосомах, большая часть которых связана с эндоплазматической сетью. В митохондриях происходят окислительные реакции, совокупность которых называется внутриклеточным дыханием. Хлоропласты отвечают за фотосинтез.
Клетки бактерий устроены проще. Обычно они имеют только две мембраны — внешнюю и внутреннюю. Бактерия — это как бы мешок в мешке, а точнее, очень мелкий пузырек с двойной стенкой. Здесь нет ни ядра, ни митохондрий, ни хлоропластов.
Существует гипотеза, что митохондрии и хлоропласты произошли из бактерий, захваченных клеткой более крупного и высокоорганизованного существа. Действительно, биохимия митохондрий и хлоропластов во многом напоминает бактериальную. Морфологически митохондрии и хлоропласты тоже в известном смысле подобны бактериям: они окружены двумя мембранами. Во всех трех случаях: в бактериях, митохондриях и хлоропластах — синтез АТФ происходит во внутренней мембране.
Долгое время считалось, что образование АТФ при дыхании и фотосинтезе протекает аналогично уже известному превращению энергии при гликолизе (фосфорилирование расщепляемого вещества, его окисление и перенос остатка фосфорной кислоты на АДФ). Однако все попытки экспериментально доказать эту схему оканчивались неудачей.
Аденозинтрифосфорная кислота-АТФ — обязательный энергетический компонент любой живой клетки. АТФ также нуклеотид, состоящий из азотистого основания аденина, сахара рибозы и трех остатков молекулы фосфорной кислоты. Это неустойчивая структура. В обменных процессах от нее последовательно отщепляются остатки фосфорной кислоты путем разрыва богатой энергией, но непрочной связи между вторым и третьим остатками фосфорной кислоты. Отрыв одной молекулы фосфорной кислоты сопровождается выделением около 40 кДж энергии. В этом случае АТФ переходит в аденозиндифосфорную кислоту (АДФ), а при дальнейшем отщеплении остатка фосфорной кислоты от АДФ образуется аденозинмонофосфорная кислота (АМФ).
Схема строения АТФ и превращения ее в АДФ (Т.А. Козлова, В.С. Кучменко. Биология в таблицах. М.,2000)
Следовательно, АТФ — своеобразный аккумулятор энергии в клетке, который «разряжается» при ее расщеплении. Распад АТФ происходит в процессе реакций синтеза белков, жиров, углеводов и любых других жизненных функций клеток. Эти реакции идут с поглощением энергии, которая извлекается в ходе расщепления веществ.
АТФ синтезируется в митохондриях в несколько этапов. Первый из них — подготовительный — протекает ступенчато, с вовлечением на каждой ступени специфических ферментов. При этом сложные органические соединения расщепляются до мономеров: белки — до аминокислот, углеводы — до глюкозы, нуклеиновые кислоты — до нуклеотидов и т. д. Разрыв связей в этих веществах сопровождается выделением небольшого количества энергии. Образовавшиеся мономеры под действием других ферментов могут претерпеть дальнейший распад с образованием более простых веществ вплоть до диоксида углерода и воды.
Схема Синтез АТФ в мвтохондрии клетки
ПОЯСНЕНИЯ К СХЕМЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ В ПРОЦЕССЕ ДИССИМИЛЯЦИИ
I этап — подготовительный: сложные органические вещества под действием пищеварительных ферментов распадаются на простые, при этом выделяется только тепловая энергия.
Белки ->аминокислоты
Жиры-> глицерин и жирные кислоты
Крахмал ->глюкоза
II этап-гликолиз (бескислородный): осуществляется в гиалоплазме, с мембранами не связан; в нем участвуют ферменты; расщеплению подвергается глюкоза:
У дрожжевых грибов молекула глюкозы без участия кислорода превращается в этиловый спирт и диоксид углерода (спиртовое брожение):
У других микроорганизмов гликолиз может завершаться образованием ацетона, уксусной кислоты и т, д. Во всех случаях распад одной молекулы глюкозы сопровождается образованием двух молекул АТФ. В ходе бескислородного расщепления глюкозы в виде химической связи в молекуле АТФ сохраняется 40% анергии, а остальная рассеивается в виде теплоты.
III этап-гидролиз (кислородный): осуществляется в митохондриях, связан с матриксом митохондрий и внутренней мембраной, в нем участвуют ферменты, расщеплению подвергается молочная кислота: СзН6Оз+ЗН20 —>3СО2+ 12Н. С02 (диоксид углерода) выделяется из митохондрий в окружающую среду. Атом водорода включается в цепь реакций, конечный результат которых — синтез АТФ. Эти реакции идут в такой последовательности:
1. Атом водорода Н с помощью ферментов-переносчиков поступает во внутреннюю мембрану митохондрий, образующую кристы, где он окисляется: Н-е—>H+
2. Протон водорода H+ (катион) выносится переносчиками на наружную поверхность мембраны крист. Для протонов эта мембрана непроницаема, поэтому они накапливаются в межмембранном пространстве, образуя протонный резервуар.
3. Электроны водорода e переносятся на внутреннюю поверхность мембраны крист и тут же присоединяются к кислороду с помощью фермента оксидазы, образуя отрицательно заряженный активный кислород (анион): O2 + е—>O2-
4. Катионы и анионы по обе стороны мембраны создают разноименно заряженное электрическое поле, и когда разность потенциалов достигнет 200 мВ, начинает действовать протонный канал. Он возникает в молекулах ферментов АТФ-синтетаз, которые встроены во внутреннюю мембрану, образующую кристы.
5. Через протонный канал протоны водородаH+ устремляются внутрь митохондрий, создавая высокий уровень энергии, большая часть которой идет на синтез АТФ из АДФ и Ф (АДФ+Ф—>АТФ), а протоны H+ взаимодействуют с активным кислородом, образуя воду и молекулярный 02:
(4Н++202- —>2Н20+02)
Таким образом, О2, поступающий в митохондрии в процессе дыхания организма, необходим для присоединения протонов водорода Н. При его отсутствии весь процесс в митохондриях прекращается, так как электронно-транспортная цепь перестает функционировать. Общая реакция III этапа:
(2СзНбОз + 6Oз + 36АДФ + 36Ф —> 6С02 + 36АТФ + +42Н20)
В результате расщепления одной молекулы глюкозы образуются 38 молекул АТФ: на II этапе — 2 АТФ и на III этапе — 36 АТФ. Образовавшиеся молекулы АТФ выходят за пределы митохондрии и участвуют во всех процессах клетки, где необходима энергия. Расщепляясь, АТФ отдает энергию (одна фосфатная связь заключает 40 кДж) и в виде АДФ и Ф (фосфата) возвращается в митохондрии.
АТФ или по полной расшифровке аденозинтрифосфорная кислота, является «аккумулятором» энергии в клетках организма. Ни одна биохимическая реакция не проходит без участия АТФ. Молекулы АТФ находятся в ДНК и РНК.
Состав АТФ
Молекула АТФ имеет три составляющих: три остатка фосфорной кислоты, аденин и рибоза. То есть, АТФ имеет строение нуклеотида и относится к нуклеиновым кислотам. Рибоза-это углевод,а аденин-азотистое основание. Остатки кислоты объединены друг с другом неустойчивыми энергетическими связями. Энергия появляется при отщеплении молекул кислоты. Отделение происходит благодаря биокатализаторам. После отъединения, молекула АТФ уже превращается в АДФ (если отщепилась одна молекула) или в АМФ (если отщепились две молекулы кислоты). При отделении одной молекулы фосфорной кислоты выходит 40 кДж энергии.
Роль в организме
АТФ играет не только энергетическую роль в организме,но и ряд других:
- является результатом синтезирования нуклеиновых кислот.
- регулирование многие биохимических процессов.
- сигнального вещества в других взаимодействиях клеток.
Синтез АТФ
Получение АТФ проходит в хлоропластах и митохондриях. Важнейший процесс в синтезировании молекул АТФ — это диссимиляции. Диссимиляция — это разрушение сложного до более простого.
Синтез АТФ проходит не в один этап, а в три этапа:
- Первый этап — подготовительный. Под действием ферментов в пищеварении происходит распад того, что мы поглотили. При этом жиры разлагаются до глицерина и жирных кислот, белки до аминокислот, а крахмал до глюкозы. То есть, всё подготавливается для дальнейшего использования. Выделяется тепловая энергия
- Второй этап — это гликолиз (безкислородный). Вновь происходит распад, но здесь распаду подвергается ещё и глюкоза. Так же участвуют ферменты. Но 40 % энергии остаются в АТФ, а остальное расходуется в тепло.
- Третий этап — гидролиз (кислородный). Он происходит уже в самих митохондриях. Здесь участие принимает и кислород, который мы вдыхаем, и ферменты. После полной диссимиляции выделяется энергия для образования АТФ.
• Спинор-М
АТФ – основа жизни. Участвует в процессах метаболизма и регулирует биохимические реакции в организме.
Впервые влияние КВЧ излучения на синтез АТФ было зафиксировано в эксперименте на листьях комнатного растения Balsaminus. Как известно, АТФ является универсальным химическим источником энергии в живой клетке. Увеличение синтеза АТФ под действием ММ-волн имеет определяющее значение в жизнедеятельности организмов, что находит косвенное подтверждение в лечебной практике (нормализация процессов жизнедеятельности больного организма), а также в эксперименте (повышение синтеза биологически активных веществ).
Каждое живое существо должно получать энергию из окружающей среды (например, в форме солнечного излучения или органических продуктов питания). Эта энергия требует для биосинтеза (анаболизма) огромного числа химических соединений и биополимеров в соответствии с определенной генетической программой. Сама энергия нужна для активной передачи молекул и ионов через мембраны, для движения и для передачи нервных импульсов. Наука, которая изучает поток и использование энергии в живых существах, называется «биоэнергетика» (био- + энергия).
Роль АТФ в энергетическом балансе
АТФ является основной молекулой энергии в живых системах. Он участвует в различных химических процессах, от химического биосинтеза до движения ресничек, сокращения мышц, активного транспорта молекул через клеточную мембрану или распространения электрического импульса через нервные волокна.
Производство и потребление энергии происходит через сеть ферментативных реакций (метаболизм). Центральным химическим соединением в метаболизме является аденозинтрифосфат (АТФ), который образуется в результате метаболических реакций (катаболизм) путем фосфорилирования аденозиндифосфата (АДФ) с образованием энергии около 30 кДж / моль (термодинамика). Большая часть АТФ производится в результате процессов в митохондриях (окислительного фосфорилирования). При использовании этой энергии в биологических процессах АТФ обычно гидролизуется до фосфата и АДФ (аденозинДИфосфата).
Вся биосинтетическая деятельность, как и многие другие клеточные действия, требует энергии. В основном для клеточных активностей источником энергии является именно АТФ. Молекула АТФ состоит из аденина, рибозы и трех фосфатных групп (ФГ). Последние с сильным отрицательным зарядом связаны двумя ковалентными высокоэнергетическими связями, которые при гидролизе выделяют относительно много энергии. Это демонстрирует важное свойство АТФ.
Поэтому без преувеличения можно сказать, что наиболее важным энергетическим соединением в клетке является трифосфат аденозина (АТФ), который по своему химическому составу является нуклеотидом.
Молекула АТФ состоит из:
- — азотно-аденинового основания пурина;
- — пентозы, рибозы и моносахариды;
- — трех фосфатных групп, обозначенных как альфа, бета и гамма (начиная с рибозы).
Синтез АТФ в организме
АТФ чаще всего производится в митохондрии, в основном в результате расщепления глюкозы и жирных кислот в процессе, называемом окислительным фосфорилированием; разложение 1 молекулы глюкозы в митохондрии высвобождает 36 молекул АТФ. Также АТФ синтезируется в хлоропластах, при фотосинтезе в процессе фотосинтетического фосфорилирования.
Использование АТФ в клетке
АТФ не может храниться в качестве резерва, поэтому он расходуется после его синтеза путем дефосфорилирования с помощью фермента АТФазы. Две конечные фосфорные группы связаны богатыми энергией ковалентными связями. Когда эти связи разрушаются, высвобождается относительно большое количество энергии. Если от АТФ освободить один конец ФГ, то образуется аденозин дифосфат (АДФ), освободить другой — получится аденозинмонофосфат (АМФ).
Фосфорная группа, высвобождаемая из АТФ или АДФ, богата энергией и, связываясь с соединением, обогащает ее энергией (процесс, называемый фосфорилированием). Таким образом, энергия от АТФ используется в процессах анаболизма.
АТФ создается в качестве основного энергетического продукта процесса разложения пищевых ингредиентов в процессе окисления. Часть энергии, выделяемой в этих процессах, сохраняется в форме АТФ, а остальная часть используется в форме тепла. Полученный таким образом АТФ используется для взаимодействия со всеми типами клеток. Только около 1/3 АТФ расходуется на реакции анаболизма. Остальная энергия расходуется на движение, сокращение мышц, транспортировку вещества через клеточную мембрану и т. д.
Фосфорилирование, регенерация АТФ.
Восстановление (синтез) АТФ реализуется путем связывания ФГ сначала с АМФ, что приводит к АДФ, а затем из АТФ под контролем фермента АТФ-синтазы. Это возможно благодаря тепловым реакциям, в которых энергоемкие (анаболические) реакции связаны с энерговыделительными (катаболическими) реакциями. Энергия, выделяемая при катаболизме, используется для повторного синтеза АТФ из АДФ. Следовательно, система АТФ / АДФ служит универсальным способом обмена энергией, который балансирует между выделяемыми и потребляющими энергию реакциями.
Функциональные характеристики АТФ.
Химическая связь, представляющая собой сумму сил, которые удерживают вместе атомы в молекуле, является стабильной конфигурацией, и для разрыва старой связи и образования новой требуется энергия. Ферменты значительно снижают потребность в активации большого количества энергии, но для того, чтобы химические реакции происходили в живых организмах, необходимо, чтобы энергия связи в продуктах реакции всегда была меньше энергии связи реагентов.
Молекула, наиболее часто участвующая в тепловых реакциях, — АТФ. Внутренняя структура молекул АТФ отлично подходит для этой роли в живых системах. В лабораторных условиях при удалении третьей фосфатной группы образуются АДФ и фосфат, и выделяется около 7 ккал (30 кДж) на моль АТФ. Удаление второй фосфатной группы дает AMФ и фосфат, высвобождая такое же количество энергии.
Энергия, выделяемая при удалении фосфатных групп, не только возникает из высокоэнергетических связей, но также является результатом перераспределения орбит в молекулах АТФ или АДФ. Каждая фосфатная группа несет отрицательный заряд и поэтому имеет тенденцию отталкиваться от другой такой группы. Когда фосфатная группа удаляется, происходит изменение конфигурации электронов, в результате чего получается структура с меньшей энергией.
В живых системах АТФ также гидролизуется до АДФ. Гидролиз АТФ является, например, быстрым способом выработки тепла у животных, которые просыпаются от зимней спячки. Однако обычно конечный продукт не просто удаляется, а переносится через фермент (киназу) в другую молекулу (фосфорилирование). Эта реакция также передает часть энергии от высокоэнергетической связи фосфорилированному соединению, которое, таким образом, обогащается энергией при реакции.
Энергия, выделяемая в реакциях клеточного метаболизма, таких как расщепление глюкозы, используется для повторного синтеза АТФ из молекул АДФ. Основными механизмами синтеза АТФ в клетке являются окислительное фосфорилирование в процессе клеточного дыхания (на внутренней стороне митохондриальной мембраны) и фосфорилирование в процессе фотосинтеза.
Митохондрии
Митохондрии представляют собой мембранные органеллы, присутствующие в клетках практически всех эукариотических организмов. Митохондрии заключены в две мембраны: внешняя, находящаяся в контакте с цитоплазмой, и мембрана, ограничивающая внутреннюю часть митохондрий. Между этими двумя мембранами находится межмембранное пространство. Внутренняя часть митохондрий заполнена матриксом. Типичная эукариотическая клетка содержит около 2000 митохондрий.
Внешняя митохондриальная мембрана определяет форму этой органеллы и, благодаря наличию каналообразующего белка (порина), проницаема для определенных молекул.
Внутренняя митохондриальная мембрана имеет в несколько раз большую площадь поверхности, чем наружная мембрана. Ее поверхность значительно увеличивают кристы, ориентированные к центру органеллы. Кристы могут различаться по количеству, размеру и форме, при этом они имеют частицы, прикрепленные к ним с помощью коротких ручек. Эти частицы содержат АТФ-синтазы, ферментный комплекс, участвующий в синтезе АТФ.
Матрикс заполняет внутреннюю часть митохондрий и представляет собой смесь нескольких сотен ферментов, которые преобразуют продукты метаболизма углеводов, липидов и белков через цикл Кребса в углекислый газ и воду с выделением энергии в виде молекул АТФ. В этом процессе электроны переносятся по дыхательной электронной цепи, и происходит синтез высокоэнергетического фосфатного соединения, АТФ (окислительное фосфорилирование).
Источник http://medicine-simply.ru/just-medicine/57
состав, функции и роль в организме. Структура АТФ. Значение АТФ Функции адф и амф
В любой клетке нашего организма протекают миллионы биохимических реакций. Они катализируются множеством ферментов, которые зачастую требуют затрат энергии. Где же клетка ее берет? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть строение молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.
АТФ — универсальный источник энергии
АТФ расшифровывается как аденозинтрифосфат, или аденозинтрифосфорная кислота. Вещество является одним из двух наиболее важных источников энергии в любой клетке. Строение АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций может протекать только при участии молекул вещества, особенно это касается Однако АТФ редко непосредственно участвует в реакции: для протекания любого процесса нужна энергия, заключенная именно в аденозинтрифосфата.
Строение молекул вещества таково, что образующиеся связи между фосфатными группами несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи также называются макроэргическими, или макроэнергетическими (макро=много, большое количество). Термин впервые ввел ученый Ф. Липман, и он же предложил использовать значок ̴ для их обозначения.
Очень важно для клетки поддерживать постоянный уровень содержания аденозинтрифосфата. Особенно это характерно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и для выполнения своих функций нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата.
Строение молекулы АТФ
Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков
Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз. Это значит, что в составе рибозы 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с аденином β-N-гликозидной связь на 1-ом атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-ом атоме углерода.
Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединяется к рибозе, выделяют также ГТФ (гуанозинтрифосфат), ТТФ (тимидинтрифосфат), ЦТФ (цитидинтрифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат). Все эти вещества схожи по строению с аденозинтрифосфатом и выполняют примерно такие же функции, однако они встречаются в клетке намного реже.
Остатки фосфорной кислоты . К рибозе может присоединиться максимально три остатка фосфорной кислоты. Если их два или только один, то соответственно вещество называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между фосфорными остатками заключены макроэнергетические связи, после разрыва которых высвобождается от 40 до 60 кДж энергии. Если разрываются две связи, выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. При разрыве связи между рибозой и фосфорным остатком выделяется всего лишь 13,8 кДж, поэтому в молекуле трифосфата только две макроэргические связи (Р ̴ Р ̴ Р), а в молекуле АДФ — одна (Р ̴ Р).
Вот каковы особенности строения АТФ. По причине того, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, строение и функции АТФ связаны между собой.
Строение АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата
Кроме энергетической, АТФ может выполнять множество других функций в клетке. Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами трифосфат участвует в построении нуклеиновый кислот. В этом случае АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и УТФ являются поставщиками азотистых оснований. Это свойство используется в процессах и транскрипции.
Также АТФ необходим для работы ионных каналов. Например, Na-K канал выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и вкачивает 2 молекулы калия в клетку. Такой ток ионов нужен для поддержания положительного заряда на наружной поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать. То же касается протонных и кальциевых каналов.
АТФ является предшественником вторичного мессенжера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами мембраны клетки, но и является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Так, циклический аденозинтрифосфат ингибирует синтез фермента, который катализирует расщепление лактозы в клетках бактерии.
Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором. Причем в подобных процессах антагонистом АТФ выступает АДФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат затормаживает, и наоборот. Таковы функции и строение АТФ.
Как образуется АТФ в клетке
Функции и строение АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Поэтому синтез трифосфата — это важный процесс образования энергии в клетке.
Выделяют три наиболее важных способа синтеза аденозинтрифосфата:
1. Субстратное фосфорилирование.
2. Окислительное фосфорилирование.
3. Фотофосфорилирование.
Субстратное фосфорилирование основано на множественных реакциях, протекающих в цитоплазме клетки. Эти реакции получили название гликолиза — анаэробный этап В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется две молекулы которые дальше используются для получения энергии, и также синтезируются два АТФ.
- С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн —> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.
Дыхание клетки
Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем передачи электронов по электронно-транспортной цепи мембраны. В результате такой передачи формируется градиент протонов на одной из сторон мембраны и с помощью белкового интегрального комплекта АТФ-синтазы идет построение молекул. Процесс протекает на мембране митохондрий.
Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс под названием дыхание. После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.
Фотофосфорилирование
Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование лишь с одним отличием: реакции фотофосфорилирования протекают в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется во время световой стадии фотосинтеза — основного процесса получения энергии у зеленых растений, водорослей и некоторых бактерий.
В процессе фотосинтеза все по той же электронно-транспортной цепи проходят электроны, в результате чего формируется протонный градиент. Концентрация протонов на одной из сторон мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется посредством фермента АТФ-синтазы.
В среднестатистической клетке содержится 0,04% аденозинтрифосфата от всей массы. Однако самое большое значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.
В клетке около 1 млрд молекул АТФ.
Каждая молекула живет не больше 1 минуты.
Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется в день 2000-3000 раз.
В сумме за сутки организм человека синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.
Заключение
Строение АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в процессах жизнедеятельности, ведь в макроэргических связях между фосфатными остатками содержится огромное количество энергии. Аденозинтрифосфат выполняет множество функций в клетке, и поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию вещества. Распад и синтез идут с большой скоростью, т. к. энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество любой клетки организма. Вот, пожалуй, и все, что можно сказать о том, какое строение имеет АТФ.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
- Введение
- 1.1 Химические свойства АТФ
- 1.2 Физические свойства АТФ
- 2.1
- 3.1 Роль в клетке
- 3.2 Роль в работе ферментов
- 3.4 Другие функции АТФ
- Заключение
- Библиографический список
Основным источником энергии для всех живых существ, населяющих нашу планету, служит энергия солнечного света, которую используют непосредственно только клетки зеленых растений, водорослей, зеленых и пурпурных бактерий. В этих клетках из углекислого газа и воды в процессе фотосинтеза образуются органические вещества (углеводы, жиры, белки, нуклеиновые кислоты и др.). Поедая растения, животные получают органические вещества в готовом виде. Энергия, запасенная в этих веществах, переходит вместе с ними в клетки гетеротрофных организмов.
В клетках животных организмов энергия органических соединений при их окислении превращается в энергию АТФ. (Углекислый газ и вода, выделяющиеся при этом, вновь используются автотрофными организмами для процессов фотосинтеза.) За счет энергии АТФ осуществляются все процессы жизнедеятельности: биосинтез органических соединений, движение, рост, деление клеток и др.
Аденозинтрифосфат — нуклеотид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. АТФ был открыт в 1929 году Карлом Ломанном, а в1941 году Фриц Липман показал, что АТФ является основным переносчиком энергии в клетке .
По строению АТФ сходна с адениновым нуклеотидом, входящим в состав РНК, только вместо одной фосфорной кислоты в состав АТФ входят три остатка фосфорной кислоты. Клетки не в состоянии содержать кислоты в заметных количествах, а только их соли. Поэтому фосфорная кислота входит в АТФ в виде остатка (вместо ОН-группы кислоты имеется отрицательно заряженный атом кислорода).
Эти реакции обратимы, то есть АМФ может переходить в АДФ и далее в АТФ, аккумулируя энергию. Разрушение обычной пептидной связи высвобождает лишь 12 кДж/моль энергии. А связи, которыми присоединены остатки фосфорной кислоты, высокоэнергетичны (их еще называют макроэргическими): при разрушении каждой из них выделяется 40 кДж/моль энергии. Поэтому АТФ играет в клетках центральную роль универсального биологического аккумулятора энергии. Молекулы АТФ синтезируются в митохондриях и хлоропластах (лишь незначительное их количество синтезируется в цитоплазме), а затем поступают к различным органоидам клетки, обеспечивая энергией все процессы жизнедеятельности.
При усиленной нагрузке (например, в беге на короткие дистанции) мышцы работают исключительно за счет запаса АТФ. В клетках мышц этого запаса хватает на несколько десятков сокращений, а дальше количество АТФ должно восполняться. Синтез АТФ из АДФ и АМФ происходит за счет энергии, выделяющейся при расщеплении углеводов, липидов и других веществ. На выполнение умственной работы также затрачивается большое количество АТФ. По этой причине людям умственного труда требуется повышенное количество глюкозы, расщепление которой обеспечивает синтез АТФ .
АТФ является неустойчивой молекулой. В небуферизованной воде, он гидролизуется до АДФ и фосфата. Это потому, что прочность связей между фосфатными группами в АТФ меньше, чем прочность водородных связей (гидратации облигации), между своей продукции (АДФ + фосфат), и воду. Таким образом, если АТФ и АДФ находятся в химическом равновесии в воде, почти все АТФ будет в конечном счете превращается в AДФ. Система, которая далека от равновесия содержит свободную энергию Гиббса, и способен делать работу. Живые клетки поддерживают соотношение АТФ в АДФ в точке десять порядков от равновесия, при концентрации АТФ в тысячу раз выше, чем концентрация AДФ. Это смещение от положения равновесия означает, что гидролиз АТФ в клетке выпускает большое количество свободной энергии .
Две высокоэнергетические фосфатные связи (те, которые соединяют соседние фосфаты) в молекулы АТФ несут ответственность за высокое содержание энергии этой молекулы. Энергия, запасенная в АТФ может быть освобождена от гидролиза. Расположенный дальний от сахара рибозы, г-фосфатная группа имеет более высокую энергию гидролиза, чем любой б — или в-фосфат. Связи, образованные после гидролиза или фосфорилирования остатка АТФ — ниже по энергии, чем других связей АТФ. Во время фермент-катализируемого гидролиза АТФ или АТФ фосфорилирования, имеющиеся свободная энергия может быть использована на живые системы, чтобы сделать работу .
Любая нестабильная система потенциально реактивных молекул потенциально может служить способом хранения свободной энергии, если клетки сохранили свою концентрацию далеко от точки равновесия реакции. Однако, как и в случае с большинством полимерных биомолекул, разбивка РНК, ДНК и АТФ в простые мономеры обусловлена как выделение энергии и энтропии, увеличение соображения, как в стандартной концентрации, а также тех концентрациях, в которых встречается в клетке .
Стандартное количество энергии, выделяющейся в результате гидролиза АТФ может быть рассчитана по изменениям в энергии, не связанных с природными (стандартные) условия, то исправление биологической концентрации. Чистое изменение в тепловой энергии (энтальпии) при стандартной температуре и давлении разложения АТФ в АДФ и неорганических фосфатов — 20,5 кДж / моль, с изменением свободной энергии на 3,4 кДж / моль. Энергия выпускается путем расщепления фосфата или пирофосфата от АТФ на государственный стандарт 1 М являются:
Эти значения могут быть использованы для расчета изменения энергии в физиологических условиях и клеточных АТФ / АДФ. Тем не менее, более представительная значимость, называемая энергетическим зарядом, чаще работает. Значения приведены для свободной энергии Гиббса. Эти реакции зависят от ряда факторов, включая общую ионную силу и присутствие щелочно-земельных металлов, такие как ионы Mg 2 + и Ca 2 + . В обычных условиях, ДG составляет около — 57 кДж / моль (-14 ккал / моль) .
белок биологический аккумулятор энергия
Фосфорилирование АДФ возможно двумя способами: субстратное фосфорилирование и окислительное фосфорилирование (используя энергию окисляющихся веществ). Основная масса АТФ образуется на мембранах митохондрий в ходе окислительного фосфорилирования H-зависимой АТФ-синтазой. Субстратное фосфорилирование АТФ не требует участия мембранных ферментов, оно происходит в процессе гликолиза или путём переноса фосфатной группы с других макроэргических соединений.
В организме АТФ является одним из самых часто обновляемых веществ. Так у человека продолжительность жизни одной молекулы АТФ менее 1 мин. В течение суток одна молекула АТФ проходит в среднем 2000-3000 циклов ресинтеза (человеческий организм синтезирует около 40 кг АТФ в день), то есть запаса АТФ в организме практически не создаётся, и для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянно синтезировать новые молекулы АТФ .
2 .1.1 Гл ико лиз — ферментативный процесс последовательного расщепления глюкозы в клетках, сопровождающийся синтезом АТФ. Гликолиз при аэробных условиях ведёт к образованию пировиноградной кислоты (пирувата), гликолиз в анаэробных условиях ведёт к образованию молочной кислоты (лактата). Гликолиз является основным путём катаболизма глюкозы в организме животных .
Процесс гликолиза условно можно разделить на два этапа. Первый этап, протекающий с расходом энергии 2-х молекул АТФ, заключается в расщеплении молекулы глюкозы на 2 молекулы глицеральдегид-3-фосфата. На втором этапе происходит НАД-зависимое окисление глицеральдегид-3-фосфата, сопровождающееся синтезом АТФ. Сам по себе гликолиз является полностью анаэробным процессом, то есть не требует для протекания реакций присутствия кислорода.
У аэробных организмов конечные продукты гликолиза подвергаются дальнейшим превращениям в биохимических циклах, относящихся к клеточному дыханию. В итоге после полного окисления всех метаболитов одной молекулы глюкозы на последнем этапе клеточного дыхания — окислительном фосфорилировании, происходящем на митохондриальной дыхательной цепи в присутствии кислорода, — дополнительно синтезируются ещё 34 или 36 молекулы АТФ на каждую молекулу глюкозы.
Фосфорилирование глюкозы преследует две цели: во-первых, из-за того что плазматическая мембрана, проницаемая для нейтральной молекулы глюкозы, не пропускает отрицательно заряженные молекулы Г-6-Ф, фосфорилированная глюкоза оказывается запертой внутри клетки. Во-вторых, при фосфорилировании глюкоза переводится в активную форму, способную участвовать в биохимических реакциях и включаться в метаболические циклы.
Это первая реакция субстратного фосфорилирования. С этого момента процесс расщепления глюкозы перестаёт быть убыточным в энергетическом плане, так как энергетические затраты первого этапа оказываются компенсированными: синтезируются 2 молекулы АТФ (по одной на каждый 1,3-дифосфоглицерат) вместо двух потраченных в реакциях 1 и 3 . Для протекания данной реакции требуется присутствие в цитозоле АДФ, то есть при избытке в клетке АТФ (и недостатке АДФ) её скорость снижается. Поскольку АТФ, не подвергающийся метаболизму, в клетке не депонируется а просто разрушается, то эта реакция является важным регулятором гликолиза.
Гликолиз — катаболический путь исключительной важности. Он обеспечивает энергией клеточные реакции, в том числе и синтез белка. Промежуточные продукты гликолиза используются при синтезе жиров. Пируват также может быть использован для синтезааланина, аспартата и других соединений. Благодаря гликолизу производительность митохондрий и доступность кислорода не ограничивают мощность мышц при кратковременных предельных нагрузках .
На I стадии этого процесса пируват теряет свою карбоксильную группу в результате взаимодействия с тиаминпирофосфатом (ТПФ) в составе активного центра фермента пируватдегидрогеназы (E 1). На II стадии оксиэтильная группа комплекса E 1 -ТПФ-СНОН-СН 3 окисляется с образованием ацетильнойгруппы, которая одновременно переносится на амид липоевой кислоты (кофермент), связанной с ферментомдигидроли-поилацетилтрансферазой (Е 2). Этот фермент катализирует III стадию — перенос ацетильнойгруппы на коэнзим КоА (HS-KoA) с образованием конечного продукта ацетил-КоА, который является высокоэнергетическим (макроэргическим) соединением.
На IV стадии регенерируется окисленная форма липоамида из восстановленного комплекса дигидролипоамид-Е 2 . При участии фермента дигидролипоилдегидрогеназы (Е 3) осуществляется переносатомов водорода от восстановленных сульфгидрильных групп дигидролипоамида на ФАД, который выполняет роль простетической группы данного фермента и прочно с ним связан. На V стадии восстановленный ФАДН 2 дигидро-липоилдегидрогеназы передает водород на кофермент НАД с образованием НАДН + Н + .
Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата происходит в матриксе митохондрий. В нем принимают участие (в составе сложного мультиферментного комплекса) 3 фермента (пируватдегидрогеназа, ди-гидролипоилацетилтрансфераза, дигидролипоилдегидрогеназа) и 5 кофер-ментов (ТПФ, амид липоевой кислоты, коэнзим А, ФАД и НАД), из которых три относительно прочно связаны с ферментами (ТПФ-E 1 , ли-поамид-Е 2 и ФАД-Е 3), а два — легко диссоциируют (HS-KoA и НАД).
Все эти ферменты, имеющие субъединичное строение, и коферменты организованы в единый комплекс. Поэтому промежуточные продукты способны быстро взаимодействовать друг с другом. Показано, что составляющие комплекс полипептидные цепи субъединиц дигидролипоил-ацетилтрансферазы составляют как бы ядро комплекса, вокруг которого расположены пируватдегидрогеназа и дигидролипоилдегидрогеназа. Принято считать, что нативный ферментный комплекс образуется путем самосборки.
2 .1.3 Цикл трикарбоновых кисло т (цикл Кре бса , цитра тный цикл ) — центральная часть общего пути катаболизма, циклический биохимический аэробный процесс, в ходе которого происходит превращение двух — и трёхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные продукты в живых организмах при распаде углеводов, жиров и белков, до CO 2 . При этом освобождённый водород направляется в цепь тканевого дыхания, где в дальнейшем окисляется до воды, принимая непосредственное участие в синтезе универсального источника энергии — АТФ.
Цикл Кребса — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме. Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.
У эукариот все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий, причём катализирующие их ферменты, кроме одного, находятся в свободном состоянии в митохондриальном матриксе, исключение составляет сукцинатдегидрогеназа, которая локализуется на внутренней митохондриальной мембране, встраиваясь в липидный бислой. У прокариот реакции цикла протекают в цитоплазме .
Цикл Кребса регулируется «по механизму отрицательной обратной связи», при наличии большого количества субстратов (ацетил-КоА, оксалоацетат), цикл активно работает, а при избытке продуктов реакции (НАД, ATФ) тормозится. Регуляция осуществляется и при помощи гормонов, основным источником ацетил-КоА является глюкоза, поэтому гормоны, способствующие аэробному распаду глюкозы, способствуют работе цикла Кребса. Такими гормонами являются:
· б-субъединица транспортирует АТФ к мембранному переносчику, который «выбрасывает» АТФ в цитоплазму. Взамен из цитоплазмы этот же переносчик транспортирует АДФ. На внутренней мембране митохондрий также находится переносчик Фосфата из цитоплазмы в митохондрию, но для его работы необходим протон водорода. Такие переносчики называются транслоказами .
Субстр атное фосфорил ирование (биохимическое), синтез богатых энергией фосфорных соединений за счёт энергии окислительно-восстановительных реакций гликолиза (катализируемых фосфоглице-ральдегиддегидрогеназой и енолазой) и при окислении a-кетоглутаровой кислоты в цикле трикарбоновых кислот (под действием a-кетоглутаратдегидрогеназы и сукцинаттиокиназы). Для бактерий описаны случаи С. ф. при окислении пировиноградной кислоты.С. ф., в отличие от фосфорилирования в цепи переноса электронов, не ингибируется «разобщающими» ядами (например, динитрофенолом) и не связано с фиксацией ферментов в мембранах митохондрий. Вклад С. ф. в клеточный фонд АТФ в аэробных условиях значительно меньше, чем вклад фосфорилирования в цепи переноса электронов .
Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Всё это реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного переноса молекул через биологические мембраны, в том числе и для создания трансмембранного электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения .
АТФ представляет собой термодинамически нестойкое соединение. Нестабильность АТФ определяется, во — первых, электростатическим отталкиванием в области кластера одноимённых отрицательных зарядов, что приводит к напряжению всей молекулы, однако сильнее всего связи — Р — О — Р, и во — вторых, конкретным резонансом. В соответствии с последним фактором существует конкуренция между атомами фосфора за неподелённые подвижные электроны атома кислорода, расположенного между ними, поскольку на каждом атоме фосфора имеется частичный положительный заряд в следствии значительного электронаицепторного влияния групп Р=О и Р — О-. Таким образом, возможность существования АТФ определяется наличием достаточного количества химической энергии в молекуле, позволяющей компенсировать эти физико — химические напряжения. В молекуле АТФ имеется две фосфоангидридных (пирофосфатных) связи, гидролиз которых сопровождается значительным уменьшением свободной энергии (при рН 7,0 и 37 о С).
Фосфорилирование АДФ является эндергоническим процессом и требует источника энергии. Как отмечалось ранее, в природе преобладает два таких источника энергии — это солнечная энергия и химическая энергия восстановленных органических соединений. Зелёные растения и некоторые микроорганизмы способны трансформировать энергию, поглощённых квантов света в химическую энергию, которая расходуется на фосфорилирование АДФ в световой стадии фотосинтеза. Этот процесс регенерации АТФ получил название фотосинтетического фосфорилирования. Трансформация энергии окисления органических соединений в макроэнергетические связи АТФ в аэробных условиях происходит преимущественно путём окислительного фосфорилирования. Свободная энергия, необходимая для образования АТФ, генерируется в дыхательной окислительной цепи митаходрий.
Известен ещё один тип синтеза АТФ, получивший название субстратного фосфорилирования. В отличии от окислительного фосфорилирования, сопряжённого с переносом электронов, донором активированной фосфорильной группой (- РО3 Н2), необходимой для регенерации АТФ, являются интермедианты процессов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот. Во всех этих случаях окислительные процессы приводят к образованию высокоэнергетических соединений: 1,3 — дифосфоглицерата (гликолиз), сукцинил — КоА (цикл трикарбоновых кислот), которые при участии соответствующих ферментов способны фолирировать АДФ и образовывать АТФ. Трансформация энергии на уровне субстрата является единственным путём синтеза АТФ в анаэробных организмах. Этот процесс синтеза АТФ позволяет поддерживать интенсивную работу скелетных мышц в периоды кислородного голодания. Следует помнить, что он является единственным путём синтеза АТФ в зрелых эритроцитах не имеющих митохондрий.
где Ф — фермент, Е — освобождающая энергия. В этой реакции образуется аденозинфосфорная кислота (АДФ) — остаток молекулы АТФ и органический фосфат. Энергию АТФ все клетки используют для процессов биосинтеза, движения, производство тепла, нервных импульсов, свечений (например, улюминисцентных бактерий), то есть для всех процессов жизнедеятельности .
Запас АТФ в клетке невелик. Так, в мышце запаса АТФ хватает на 20 — 30 сокращений. При усиленной, но кратковременной работе мышцы работают исключительно за счёт расщепления содержащейся в них АТФ. После окончания работы человек усиленно дышит — в этот период происходит расщепление углеводов и других веществ (происходит накопление энергии) и запас АТФ в клетках восстанавливается.
Живая клетка является далека от равновесия химическая система: ведь приближение живой системы к равновесию означает ее распад и смерть. Продукт каждого фермента обычно быстро расходуется, поскольку используется в качестве субстрата другим ферментом данного метаболического пути. Еще более важно, что большое количество ферментативных реакций связана с расщеплением АТФ на АДФ и неорганический фосфат. Чтобы это было возможным, пул АТФ в свою очередь должен поддерживаться на уровне, далеком от равновесия, так чтобы отношение концентрации АТФ в концентрации продуктов его гидролиза было высоким. Таким образом, пул АТФ играет роль «аккумулятора», поддерживающий постоянный перенес в клетке энергии и атомов по метаболическим путям, определяются присутствовать ферментами.
На пути от А — Н и Б — ОН-А — Б, связанном с гидролизом АТФ, энергия гидролиза сначала переводит Б — ОН в высокоэнергетическую промежуточную соединение, которое затем непосредственно реагирует с А — Н, образуя А — Б. простой механизм данного процесса включает в себя перенес фосфата от АТФ к Б — ОН с образованием Б — ОРО 3 , или Б — О — Р, причем в этом случае суммарная реакция происходит лишь в две стадии:
Величина G гидролиза АТФ до АДФ и неорганического фосфата зависит от концентрации всех реагирующих веществ и обычно для клетки условиях лежит в пределах от — 11 до — 13 ккал / моль. Реакция гидролиза АТФ, наконец, может быть использована для осуществления термодинамически невыгодной реакции со значением G, равным примерно +10 ккал / моль, конечно, в присутствии соответствующей последовательности реакций. Однако для многих реакций биосинтеза оказывается недостаточным даже? G = — 13 ккал / моль. В этих и других случаях путь гидролиза АТФ изменяется таким образом, что сначала образуются АМФ и РР (пирофосфат). На следующей стадии пирофосфат также подвергается гидролизу; общее изменение свободной энергии всего процесса составляет примерно — 26 ккал / моль.
Каким образом энергия гидролиза пирофосфата используется в биосинтетических реакциях? Один из путей можно продемонстрировать на примере приведенного выше синтеза соединения А — Б с А — Н и Б — ОН. При помощи соответствующего фермента Б — ОН может вступить в реакцию с АТФ и превратиться в высокоэнергетическую соединение Б — О — Р — Р. Теперь реакция состоит из трех стадий:
Поскольку фермент всегда ускоряет катализовану ним реакцию как в прямом, так и в обратном направлении, соединение А — Б может распадаться, реагируя с пирофосфатом (реакция, обратная стадии 2). Однако энергетически выгодная реакция гидролиза пирофосфата (стадия 3) способствует поддержанию стабильности соединения А-Б за счет того, что концентрация пирофосфата остается очень низкой (это предотвращает протекание реакции, обратной к стадии 2). Таким образом, энергия гидролиза пирофосфата обеспечивает протекание реакции в прямом направлении. Примером важной биосинтетических реакции такого типа является синтез полинуклеотидов .
Во всех известных организмах, дезоксирибонуклеотиды, которые составляют ДНК синтезируется под действием ферментов рибонуклеотид-редуктазы (РНР) на соответствующих рибонуклеотидах. Эти ферменты снижают остатка сахара отрибозы, чтобы дезоксирибоза путем удаления кислорода из 2″ гидроксильные группы, субстраты рибонуклеозид дифосфаты и продукты дезоксирибонуклеозид дифосфаты. Все ферменты редуктазы использоют общие сульфгидрильные радикального механизма зависит от реактивного цистеина остатков, которые окисляются с образованием дисульфидных связей в ход реакции. РНР фермент перерабатывается в результате реакции с тиоредоксином или глутаредоксином.
При синтезе нуклеиновых кислот РНК, аденозина, полученных от АТФ является одним из четырех нуклеотидов включены непосредственно в молекулах РНК, РНК-полимеразы. Энергия, это полимеризация происходит с отщеплением пирофосфата (две фосфатные группы). Этот процесс аналогичен в биосинтезе ДНК, за исключением того, что АТФ сводится к дезоксирибонуклеотиду дАТФ, перед включением в ДНК .
АТФ используется для многих клеточных функций, включая транспортную работу перемещения веществ через клеточные мембраны. Он также используется для механической работы, поставка энергии, необходимой для мышечного сокращения. Она поставляет энергию не только в сердечной мышце (для циркуляции крови) и скелетных мышц (например, за грубое движение тела), но также и к хромосомам и жгутиков, чтобы они могли выполнять свои многочисленные функции. Большую роль АТФ в химической работе, предоставлению необходимой энергии для синтеза нескольких тысяч типов макромолекул, что клетка должна существовать.
АТФ также используется в качестве включения-выключения как для контроля химических реакций и для отправки информации. Форма белковых цепей, которые производят строительные блоки и другие структуры, используемые в жизни определяется в основном слабые химические связи, которые легко исчезают и переструктурируются. Эти цепи могут сократить, удлинить, а также изменить форму в ответ на ввод или вывод энергии. Изменения в цепях изменить форму белка, а также может изменять свои функции или вызвать его, чтобы стать активным или неактивным.
Роль в метаболизме, синтезе и активном транспортеТаким образом, АТФ передает энергию между пространственно разделенных метаболических реакций. АТФ является основным источником энергии для большинства клеточных функций. Это включает в себя синтез макромолекул, включая ДНК и РНК, и белки. АТФ также играет важную роль в транспорте макромолекул через клеточные мембраны, например, экзоцитоза и эндоцитоза.
Роль в структуре клеток и передвиженияATФ участвует в поддержании клеточной структуры путем облегчения монтажа и демонтажа элементов цитоскелета. В связи с этим процессом, АТФ, необходимых для сокращения нитей актина и миозина необходимых для мышечного сокращения. Этот последний процесс является одним из основных требований энергию животных и имеет важное значение для движения и дыхания.
Роль в сигнальных системах Во внеклеточных сигнальных системахАТФ также является сигнальной молекулой. АТФ, АДФ, или аденозин признаны пуринергическими рецепторов. Пуринорецепторы могут быть наиболее распространенных рецепторов в тканях млекопитающих.
У людей этой сигнализации роль важна как в центральной и периферической нервной системы. Активность зависит от выпуска АТФ из синапсов, аксонов и глии пуринергическими активирует рецепторы мембраны
Во внутриклеточных сигнальных системахАТФ имеет решающее значение в передаче сигнала процессов. Он используется киназ в качестве источника фосфатных групп в их реакции фосфата передачи. Киназы на подложках, таких как белки или липиды мембраны являются распространенной формой сигнала. Фосфорилирование белка по киназе могут активировать этот каскад, такие как митогенактивированной протеинкиназыкаскада.
АТФ используется также аденилатциклазу и превращается в вторичный мессенджер молекулы АМФ, который участвует в запуске кальция сигналы высвобождение кальция из внутриклеточных депо. [ 38 ] Эта форма сигнала имеет особенно важное значение в функции мозга, хотя он участвует в регуляции множества других клеточных процессов .
1. Аденозинтрифосфат — нуклеотид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. Химически АТФ представляет собой трифосфорный эфир аденозина, который является производным аденина и рибозы. По строению АТФ сходна с адениновым нуклеотидом, входящим в состав РНК, только вместо одной фосфорной кислоты в состав АТФ входят три остатка фосфорной кислоты. Клетки не в состоянии содержать кислоты в заметных количествах, а только их соли. Поэтому фосфорная кислота входит в АТФ в виде остатка (вместо ОН-группы кислоты имеется отрицательно заряженный атом кислорода).
3. Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. В биоэнергетике живых организмов имеют значение: химическая энергия запасается путём образования АТФ, сопряжённого с экзергоническими катаболическими реакциями окисления органических субстратов; химическая энергия утилизируется путём расщепления АТФ, сопряжённого с эндергоническими реакциями анаболизма и другими процессами, требующими затраты энергии.
4. При усиленной нагрузке (например, в беге на короткие дистанции) мышцы работают исключительно за счет запаса АТФ. В клетках мышц этого запаса хватает на несколько десятков сокращений, а дальше количество АТФ должно восполняться. Синтез АТФ из АДФ и АМФ происходит за счет энергии, выделяющейся при расщеплении углеводов, липидов и других веществ. На выполнение умственной работы также затрачивается большое количество АТФ. По этой причине людям умственного труда требуется повышенное количество глюкозы, расщепление которой обеспечивает синтез АТФ.
1. Лемеза, Н.А. Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы / Л.В. Камлюк Н.Д. Лисов. — Мн.: Юнипресс, 2011 г. — 624 с.
2. Lodish, H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J. Molecular Cell Biology, 5th ed. — New York: WH Freeman, 2004.
3. Романовский, Ю.М. Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза — вращающийся молекулярный мотор / Ю.М. Романовский А.Н. Тихонов // УФН. — 2010. — Т.180. — С.931 — 956.
4. Voet D, Voet JG. Biochemistry Vol 1 3rd ed. — Wiley: Hoboken, NJ. — N-Y: W. H. Freeman and Company, 2002. — 487 р.
5. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. М.: Высшая школа, 1993 г
6. Вершубский, А.В. Биофизика. / А.В. Вершубский, В.И. Прик-лонский, А.Н. Тихонов. — М: 471-481.
7. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки в 3-х томах. / Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. М.: Мир, 1994.1558 с.
8. Николаев А.Я. Биологическая химия — М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 1998.
9. Berg, J. M. Biochemistry, international edition. / Berg, J. M, Tymoczko, J. L, Stryer, L. — New York: WH Freeman, 2011; p 287.
10. Кнорре Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. И мед. спец. вузов. — 3-е изд., испр. / Кнорре Д.Г., Мысина С.Д. — М.: Высш. шк., 2000. — 479 с.: ил.
11. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Элиот, Д. Элиот. — М.: Изд-во НИИ Биомедицинской химии РАМН, ООО «Материк-альфа», 1999, — 372 с.
12. Shina CL, K., 7 Areieh, W. On the Energetics of ATP Hydrolysis in Solution. Journal Of Physical Chemistry B,113 (47), (2009).
13. Berg, J. M. Biochemistry / J. M. Berg: J. L. Tymoczko, L. Stryer. — N-Y: W. H. Freeman and Company, 2002. — 1514 p.
…Подобные документы
Органические соединения в организме человека. Строение, функции и классификация белков. Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), особенности строений и свойства РНК н ДНК. Углеводы в природе и организме человека. Липиды — жиры и жироподобные вещества.
реферат , добавлен 06.09.2009
Процесс синтеза белков и их роль в жизнедеятельности живых организмов. Функции и химические свойства аминокислот. Причины их нехватки в организме человека. Виды продуктов, в которых содержатся незаменимые кислоты. Аминокислоты, синтезируемые в печени.
презентация , добавлен 23.10.2014
Энергетическая, запасающая и опорно-строительная функции углеводов. Свойства моносахаридов как основного источника энергии в организме человека; глюкоза. Основные представители дисахаридов; сахароза. Полисахариды, образование крахмала, углеводный обмен.
доклад , добавлен 30.04.2010
Функции обмена веществ в организме: обеспечение органов и систем энергией, вырабатываемой при расщеплении пищевых веществ; превращение молекул пищевых продуктов в строительные блоки; образование нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и других компонентов.
реферат , добавлен 20.01.2009
Роль и значение белков, жиров и углеводов для нормального протекания всех жизненно важных процессов. Состав, структура и ключевые свойства белков, жиров и углеводов, их важнейшие задачи и функции в организме. Основные источники данных пищевых веществ.
презентация , добавлен 11.04.2013
Характеристика структуры холестериновых молекул как важного компонента клеточной мембраны. Исследование механизмов регуляции обмена холестерина в организме человека. Анализ особенностей возникновения избытка липопротеидов низкой плотности в кровотоке.
реферат , добавлен 17.06.2012
Обмен белков, липидов и углеводов. Типы питания человека: всеядность, раздельное и низкоуглеводное питание, вегетарианство, сыроедение. Роль белков в обмене веществ. Недостаток жиров в организме. Изменения в организме в результате изменения типа питания.
курсовая работа , добавлен 02.02.2014
Рассмотрение участия железа в окислительных процессах и в синтезе коллагена. Ознакомление со значением гемоглобина в процессах кровообразования. Головокружения, одышка и нарушение обмена веществ как результат дефицита железа в человеческом организме.
презентация , добавлен 08.02.2012
Свойства фтора и железа. Суточная потребность организма. Функции фтора в организме, влияние, смертельная доза, взаимодействие с другими веществами. Железо в организме человека, его источники. Последствия дефицита железа для организма и его переизбытка.
презентация , добавлен 14.02.2017
Белки как источники питания, их основные функции. Аминокислоты, участвующие в создании белков. Строение полипептидной цепи. Превращения белков в организме. Полноценные и неполноценные белки. Структура белка, химические свойства, качественные реакции.
Важнейшим веществом в клетках живых организмов является аденозинтрифосфорная кислота или аденозинтрифосфат. Если ввести аббревиатуру этого названия, то получим АТФ (англ. ATP). Это вещество относится к группе нуклеозидтрифосфатов и играет ведущую роль в процессах метаболизма в живых клетках, являясь для них незаменимым источником энергии.
Вконтакте
Одноклассники
Первооткрывателями АТФ стали учёные-биохимики гарвардской школы тропической медицины — Йеллапрагада Суббарао, Карл Ломан и Сайрус Фиске. Открытие произошло в 1929 году и стало главной вехой в биологии живых систем. Позднее, в 1941 году, немецким биохимиком Фрицем Липманом было установлено, что АТФ в клетках является основным переносчиком энергии.
Строение АТФ
Эта молекула имеет систематическое наименование, которое записывается так: 9-β-D-рибофуранозиладенин-5′-трифосфат, или 9-β-D-рибофуранозил-6-амино-пурин-5′-трифосфат. Какие соединения входят в состав АТФ? Химически она представляет собой трифосфорный эфир аденозина — производного аденина и рибозы . Это вещество образуется путём соединения аденина, являющегося пуриновым азотистым основанием, с 1′-углеродом рибозы при помощи β-N-гликозидной связи. К 5′-углероду рибозы затем последовательно присоединяются α-, β- и γ-молекулы фосфорной кислоты.
Таким образом, молекула АТФ содержит такие соединения, как аденин, рибозу и три остатка фосфорной кислоты. АТФ — это особое соединение, содержащее связи, при которых высвобождается большое количество энергии. Такие связи и вещества называются макроэргическими. Во время гидролиза этих связей молекулы АТФ происходит выделение количества энергии от 40 до 60 кДж/моль, при этом данный процесс сопровождается отщеплением одного или двух остатков фосфорной кислоты.
Вот как записываются эти химические реакции :
- 1). АТФ + вода→АДФ + фосфорная кислота + энергия;
- 2). АДФ + вода→АМФ + фосфорная кислота + энергия.
Энергия, высвобожденная в ходе указанных реакций, используется в дальнейших биохимических процессах, требующих определённых энергозатрат.
Роль АТФ в живом организме. Её функции
Какую функцию выполняет АТФ? Прежде всего, энергетическую. Как уже было выше сказано, основной ролью аденозинтрифосфата является энергообеспечение биохимических процессов в живом организме. Такая роль обусловлена тем, что благодаря наличию двух высокоэнергетических связей, АТФ выступает источником энергии для многих физиологических и биохимических процессов, требующих больших энергозатрат. Такими процессами являются все реакции синтеза сложных веществ в организме. Это, прежде всего, активный перенос молекул через клеточные мембраны, включая участие в создании межмембранного электрического потенциала, и осуществление сокращения мышц.
Кроме указанной, перечислим ещё несколько, не менее важных, функций АТФ , таких, как:
Как образуется АТФ в организме?
Синтез аденозинтрифосфорной кислоты идёт постоянно , т. к. энергия организму для нормальной жизнедеятельности нужна всегда. В каждый конкретный момент содержится совсем немного этого вещества — примерно 250 граммов, которые являются «неприкосновенным запасом» на «чёрный день». Во время болезни идёт интенсивный синтез этой кислоты, потому что требуется много энергии для работы иммунной и выделительной систем, а также системы терморегуляции организма, что необходимо для эффективной борьбы с начавшимся недугом.
В каких клетках АТФ больше всего? Это клетки мышечной и нервной тканей, поскольку в них наиболее интенсивно идут процессы энергообмена. И это очевидно, ведь мышцы участвуют в движении, требующем сокращения мышечных волокон, а нейроны передают электрические импульсы, без которых невозможна работа всех систем организма. Поэтому так важно для клетки поддерживать неизменный и высокий уровень аденозинтрифосфата.
Каким же образом в организме могут образовываться молекулы аденозинтрифосфата? Они образуются путём так называемого фосфорилирования АДФ (аденозиндифосфата) . Эта химическая реакция выглядит следующим образом:
АДФ + фосфорная кислота + энергия→АТФ + вода.
Фосфорилирование же АДФ происходит при участии таких катализаторов, как ферменты и свет, и осуществляется одним из трёх способов:
Как окислительное, так и субстратное фосфорилирование использует энергию веществ, окисляющихся в процессе такого синтеза.
Вывод
Аденозинтрифосфорная кислота — это наиболее часто обновляемое вещество в организме. Сколько в среднем живёт молекула аденозинтрифосфата? В теле человека, например, продолжительность её жизни составляет менее одной минуты, поэтому одна молекула такого вещества рождается и распадается до 3000 раз за сутки. Поразительно, но в течение дня человеческий организм синтезирует около 40 кг этого вещества! Настолько велики потребности в этом «внутреннем энергетике» для нас!
Весь цикл синтеза и дальнейшего использования АТФ в качестве энергетического топлива для процессов обмена веществ в организме живого существа представляет собой саму суть энергетического обмена в этом организме. Таким образом, аденозинтрифосфат является своего рода «батарейкой», обеспечивающей нормальную жизнедеятельность всех клеток живого организма.
Моносахариды (простые сахара) состоят из одной молекулы, содержащей от 3 до 6 атомов углерода. Дисахариды — соединения, образованные из двух моносахаридов. Полисахариды являются высокомолекулярными веществами, состоящими из большого числа (от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч) моносахаридов.
Разнообразные углеводы в больших количествах содержатся в организмах. Их основные функции:
- Энергетическая: именно углеводы служат основным источником энергии для организма. Среди моносахаридов это фруктоза, широко встречающаяся в растениях (прежде всего в плодах), и особенно глюкоза (при расщеплении одного ее грамма выделяется 17,6 кДж энергии). Глюкоза содержится в плодах и других частях растений, в крови, лимфе, тканях животных. Из дисахаридов необходимо выделить сахарозу (тростниковый или свекловичный сахар), состоящую из глюкозы и фруктозы, и лактозу (молочный сахар), образованную соединением глюкозы и галактозы. Сахароза содержится в растениях (в основном в плодах), а лактоза — в молоке. Они играют важнейшую роль в питании животных и человека. Большое значение в энергетических процессах имеют такие полисахариды, как крахмал и гликоген, мономером которых выступает глюкоза. Они представляют собой резервные вещества растений и животных соответственно. При наличии в организме большого количества глюкозы она используется для синтеза этих веществ, которые накапливаются в клетках тканей и органов. Так, крахмал в больших количествах содержится в плодах, семенах, клубнях картофеля; гликоген — в печени, мышцах. По мере необходимости данные вещества расщепляются, поставляя глюкозу в различные органы и ткани организма.
- Структурная: например, такие моносахариды, как дезоксирибоза и рибоза, участвуют в формировании нуклеотидов. Различные углеводы входят в состав клеточных стенок (целлюлоза у растений, хитин у грибов).
Липиды (жиры) — органические вещества, нерастворимые в воде (гидрофобные), но хорошо растворяющиеся в органических растворителях (хлороформе, бензине и др.). Их молекула состоит из глицерина и жирных кислот. Разнообразие последних и обусловливает многообразие липидов. В мембранах клеток широко встречаются фосфолипиды (содержащие, кроме жирных, остаток фосфорной кислоты) и гликолипиды (соединения липидов и сахаридов).
Функции липидов — структурная, энергетическая и защитная.
Структурной основой клеточной мембраны выступает бимолекулярный (образованный из двух слоев молекул) слой липидов, в который встроены молекулы разнообразных белков.
При расщеплении 1 г жиров выделяется 38,9 кДж энергии, что примерно вдвое больше, чем при расщеплении 1 г углеводов или белков. Жиры могут накапливаться в клетках разных тканей и органов (печени, подкожной клетчатке у животных, семенах у растений), в больших количествах образуя значительный запас «топлива» в организме.
Обладая плохой теплопроводностью, жиры играют важную роль в защите от переохлаждения (например, слои подкожного жира у китов и ластоногих).
АТФ (аденозинтрифосфат). Он служит в клетках универсальным энергоносителем. Энергия, выделяющаяся при расщеплении органических веществ (жиры, углеводы, белки и т. д.), не может использоваться непосредственно для выполнения какой-либо работы, а запасается первоначально в форме АТФ.
Аденозинтрифосфат состоит из азотистого основания аденина, рибозы и трех молекул (а точнее, остатков) фосфорной кислоты (рис. 1).
Рис. 1. Состав молекулы АТФ
При отщеплении одного остатка фосфорной кислоты образуется АДФ (аденозиндифосфат) и высвобождается около 30 кДж энергии, которая расходуется на выполнение какой-либо работы в клетке (например, сокращение мышечной клетки, процессы синтеза органических веществ и т. д.):
Так как запас АТФ в клетке ограничен, он постоянно восстанавливается за счет энергии, выделяющейся при расщеплении других органических веществ; восстановление АТФ происходит путем присоединения молекулы фосфорной кислоты к АДФ:
Таким образом, в биологическом преобразовании энергии можно выделить два основных этапа:
1) синтез АТФ — запасание энергии в клетке;
2)высвобождение запасенной энергии (в процессе расщепления АТФ) для совершения работы в клетке.
На рисунке представлены два способа изображения структуры АТФ . Аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ) относятся к классу соединений, называемых нуклеогидами. Молекула нук-леотида состоит из пятиуглеродного сахара, азотистого основания и фосфорной кислоты. В молекуле АМФ сахар представлен рибо-зой, а основание — аденином. В молекуле АДФ две фосфатные группы, а в молекуле АТФ — три.
Значение АТФ
При расщеплении АТФ на АДФ и неорганический фосфат (Фн) высвобождается энергия:
Реакция идет с поглощением воды , т. е. представляет собой гидролиз (в нашей статье мы много раз встречались с этим весьма распространенным типом биохимических реакций). Отщепившаяся от АТФ третья фосфатная группа остается в клетке в виде неорганического фосфата (Фн). Выход свободной энергии при этой реакции составляет 30,6 кДж на 1 моль АТФ.
Из АДФ и фосфата может быть вновь синтезирован АТФ, но для этого требуется затратить 30,6 кДж энергии на 1 моль вновь образованного АТФ.
В этой реакции , называемой реакцией конденсации, вода выделяется. Присоединение фосфата к АДФ называется реакцией фосфорилирования. Оба приведенных выше уравнения можно объединить:
Катализирует данную обратимую реакцию фермент, называемый АТФазой .
Всем клеткам, как уже было сказано, для выполнения их работы необходима энергия и для всех клеток любого организма источником этой энергии служит АТФ . Поэтому АТФ называют «универсальным носителем энергии» или «энергетической валютой» клеток. Подходящей аналогией служат электрические батарейки. Вспомните, для чего только мы их не используем. Мы можем получать с их помощью в одном случае свет, в другом звук, иногда механическое движение, а иногда нам нужна от них собственно электрическая энергия. Удобство батареек в том, что один и тот же источник энергии — батарейку — мы можем использовать для самых разных целей в зависимости от того, куда мы ее поместим. Эту же роль играет в клетках АТФ. Он поставляет энергию для таких различных процессов, как мышечное сокращение, передача нервных импульсов, активный транспорт веществ или синтез белков, и для всех прочих видов клеточной активности. Для этого он должен быть просто «подключен» к соответствующей части аппарата клетки.
Аналогию можно продолжить. Батарейки требуется сначала изготовить, а некоторые из них (аккумуляторные) так же, как и , можно перезарядить. При изготовлении батареек на фабрике в них должно быть заложено (и тем самым израсходовано фабрикой) определенное количество энергии. Для синтеза АТФ тоже требуется энергия; источником ее служит окисление органических веществ в процессе дыхания. Поскольку для фосфорилирования АДФ энергия высвобождается в процессе окисления, такое фосфорилирование называют окислительным. При фотосинтезе АТФ образуется за счет световой энергии. Этот процесс называют фотофос-форилированием (см. разд. 7.6.2). Есть в клетке и «фабрики», производящие большую часть АТФ. Это митохондрии; в них размешаются химические «сборочные линии», на которых образуется АТФ в процессе аэробного дыхания. Наконец, в клетке происходит и перезарядка разрядившихся «аккумуляторов»: после того как АТФ, высвободив заключенную в нем энергию, превратится в АДФ и Фн, он может быть вновь быстро синтезирован из АДФ и Фн за счет энергии, полученной в процессе дыхания от окисления новой порции органических веществ.
Количество АТФ в клетке в любой данный момент очень невелико. Поэтому в АТФ следует видеть только носителя энергии, а не ее депо. Для длительного хранения энергии служат такие вещества, как жиры или гликоген. Клетки весьма чувствительны к уровню АТФ. Как только скорость его использования возрастает, одновременно возрастает и скорость процесса дыхания, поддерживающего этот уровень.
Роль АТФ в качестве связующего звена между клеточным дыханием и процессами, идущими с потреблением энергии, видна из рисунка Схема эта выглядит простой, но она иллюстрирует очень важную закономерность.
Можно, таким образом, сказать, что в целом функция дыхания заключается в том, чтобы вырабатывать АТФ .
Суммируем вкратце сказанное выше.
1. Для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата требуется 30,6 кДж энергии на 1 моль АТФ.
2. АТФ присутствует во всех живых клетках и является, следовательно, универсальным носителем энергии. Другие носители энергии не используются. Это упрощает дело — необходимый клеточный аппарат может быть более простым и работать более эффективно и экономно.
3. АТФ легко доставляет энергию в любую часть клетки к любому нуждающемуся в энергии процессу.
4. АТФ быстро высвобождает энергию. Для этого требуется всего лишь одна реакция — гидролиз.
5. Скорость воспроизводства АТФ из АДФ и неорганического фосфата (скорость процесса дыхания) легко регулируется в соответствии с потребностями.
6. АТФ синтезируется во время дыхания за счет химической энергии, высвобождаемой при окислении таких органических веществ, как глюкоза, и во время фотосинтеза — за счет солнечной энергии. Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата называют реакцией фос-форилирования. Если энергию для фос-форилирования поставляет окисление, то говорят об окислительном фосфорилиро-вании (этот процесс протекает при дыхании), если же для фосфорилирования используется световая энергия, то процесс называют фотофосфорилированием (это имеет место при фотосинтезе).
Спортивная адаптология — Департамент физической культуры и спорта
Виктор Николаевич Селуянов, МФТИ, лаборатория «Информационные технологии в спорте»Развитие науки приводит к появлению моделей объекта исследования, с помощью которых познаются новые свойства или разрабатываются инновационные технологии, создается теория. Для построения ТФП необходимо построить модель идеальной клетки, мышечного волокна, мышцы, нервно-мышечного аппарата, сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы, эндокринной и иммунной, пищеварительной.
Идеальная клетка
Все клетки животных устроены в первом приближении одинаково. Клетка, например, мышечное волокно имеет мембрану — сарколемму. В саркоплазме имеются все обычные органеллы и многочисленные ядра (мышечное волокно — многоядерная клетка). Специфическими органеллами являются миофибриллы.
Структурными компонентами клетки являются:
— плазма, прозрачная жидкость с включением белков в виде ферментов метаболизма углеводов, аминокислот, жиров (липидов) и др. веществ, а также тРНК. В плазме происходит с помощью рибосом и полирибосом строительство новых органелл.
— мембраны клетки состоят из жира (40 %) и белка (60 %). Белковые включения выполняют функции: белков-переносчиков,белков-ферментов, рецепторов, структурной основы.
— митохондрии — энергетические станции клетки, занимаются ресинтезом молекул АТФ с помощью окислительного фосфорилирования. Они потребляют кислород, углеводы, жиры и выделяют углекислый газ, воду, и ресинтезированные молекулы АТФ. Продукты метаболизма также могут проникать через мембраны митохондрий цитоплазму.
— эндоплазматическая сеть — совокупность мембран, трубочек, вакуолей. Различают гранулярную и гладкую эндоплазматическую сеть. В гранулярной ЭПС происходит синтез мембранных белков и др. компонентов клетки. Гладкая ЭПС участвует в синтезе липидов, хорошо развита в клетках эндокринной системы. Возможна связь и с синтезом гликогена.
— комплекс Гольджи — сеть мембран, выполняющих секреторную функцию.
— лизосомы — шаровидные структуры, содержащие гидролитические ферменты (протеиназы, глюкозидазы, фосфатазы, нуклеазы, липазы). Лизосомы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания. Особенно активным становятся лизосомы при закислении клетки, увеличении концентрации ионов водорода.
— рибосомы — элементарные аппараты синтеза белков.
— микротрубочки — фибриллярные образования, выполняют роль каркасных структур.
— глобулы гликогена — запас углеводов в клетке.
— капельки жира — запас жира в клетке.
— ядро — система генетически детерминации синтеза белка. Включает хроматин, ядрышки, кариоплазму и ядерную оболочку. Хроматин содержит ДНК, здесь образуются иРНК, в ядрышках образуется рибосомальная рРНК.
После выяснения структуры клетки можно рассмотреть физиологические процессы в клетке. С точки зрения теории физической подготовки интерес представляют процессы катаболизма и анаболизма.
Анаболизм обеспечивается ДНК и полирибосомами, активизируется анаболизм с помощью стероидных гормонов. Для физического развития особенно важны соматотропин (гормон роста) и тестостерон. Стероидные гормоны проникают только в активные клетки.
Катаболизм в клетке обеспечивается лизосомами. Они становятся особенно активными при закислении клетки — появлении в них ионов водорода. В этом случае увеличиваются поры в мембранах, ускоряются как процессы диффузии, так и активного транспорта.
Таким образом, физическое развитие активных клеток обеспечивается повышением концентрации стероидных гормонов в крови, при минимизации катаболизма (закисления крови). Для тренера появляется первые принципы построения тренировочного процесса:
1. Управление активностью ЦНС и мышц обеспечивается управление эндокринной системой (концентрацией стероидных гормонов — соматотропина и тестостерона в организме спортсменов).
2. Управление концентрацией гормонов в крови приводит к адаптационным перестройкам в мышечных волокнах (росту миофибрилл и митохондрий).
Эндокринная система
Эндокринная система включает несколько желез: гипофиз, шишковидная, надпочечники, гонады, поджелудочная и др. При выполнении физических упражнений в коре головного мозга возникает психическое напряжение (стресс), что вызывает активизацию гипоталамуса и активизацию работы гипофиза. Передняя доля гипофиза выделяет в кровь соматотропин, тиреотропин, АКТГ, фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинезирующий (ЛГ) гормоны.
Соматотропин (гормон роста) — проникая в мышечные волокна стимулирует синтез миофибрилл, активизируется синтез в сухожилиях и костной ткани.
ФСГ, ЛГ — активизируют гонады, что ведет к выделению в кровь тестостерона, который в мышечных волокнах активизирует синтез миофибрилл.
Хорошо известно, что концентрация соматотропина и тестостерона растет при выполнении силовых, скоростно-силовых и скоростных упражнений, а также от массы активных мышц. Поэтому развитие мышечных волокон наиболее интенсивно происходит при выполнении предельных и околопредельных по психическому напряжению упражнений при минимизации степени закисления (катаболизма) МВ.
Отсюда следует следующий педагогический принцип спортивной тренировки:
3. Наиболее эффективными (стрессорными) являются физические упражнения, выполняемые с предельным или околопредельным психическим напряжением (интенсивностью).
Иммунная система
Иммунная система включает костный мозг, тимус, лимфатические узлы и др. Костный мозг отвечает за строительство форменных элементов крови. Важнейшими факторами нормализации функционирования костного мозга являются тестостерон и витамин В12. Поэтому стрессорные нагрузки являются стимуляторами активности и развития костного мозга, а значит иммунной системы.
Мышца
Мышца состоит из мышечных волокон. Мышечные волокна принято классифицировать на быстрые и медленные. Определить мышечную композицию можно с помощью биопсии. Делают биопсию из латеральной головки четырехглавой мышцы бедра. Кусочек мышечной ткани быстро замораживают, потом делают тонкие срезы и обрабатывают химически по определенной технологии. Обычно определяют активность миозиновой АТФазы — фермента разрушающего молекулу АТФ. Затем смотрят поперечные срезы мышечных волокон и видят окраску — черные, серые и белые МВ. Подсчитывают долю на определенной поверхности или из 200 единиц МВ одинаковой окраски. Эта мышечная композиция наследуется. Нельзя практически существенно менять АТФазную активность МВ. В экспериментах с электромиостимуляцией временно можно изменять АТФазную активность, но практического значения эти эксперименты пока не имеют.
Важно отметить, что каждая мышца имеет свою собственную унаследованную мышечную композицию, поэтому взятие биопсии из одной мышцы не может дать полной картины одаренности спортсмена. Педагогическое наблюдение и тестирование может дать более полную информацию о таланте спортсмена, чем лабораторное обследование. Например, набор тестов для легкоатлетов — прыжок с места на двух ногах, многоскоки с ноги на ногу, метание ядра вперед и назад, метание гранаты, позволят в сравнении с нормами оценить одаренность различных мышечных групп у данного спортсмена. Если большинство мальчиков 11–12 лет прыгает в длину с места на 200 см, а один из них прыгнул на 250 см, то нет сомнений, что этот мальчик имеет в мышцах разгибателях суставов ног высокий процент быстрых МВ.
Существует способ классификации МВ по другим ферментам. Особый интерес представляет классификация МВ по активности ферментов митохондрий. В этом случае говорят об окислительных, промежуточных и гликолитических МВ. Эта мышечная композиция не наследуется, поскольку окислительные мышечные волокна легко превращаются в гликолитические при прекращении тренировок. Митохондрии разрушаются, стареют и через 20 дней от 100 % остается только 50 % и т. д. Спортивная форма теряется без тренировок очень быстро.
Мышечное волокно имеет специфические органеллы — миофибриллы. Миофибриллы у всех животных одинаковые по строению и различаются только по длине (количеству саркомеров). Поперечное сечение всех миофибрилл одинаковое. Поэтому сила сокращения мышечного волокна зависит от количества миофибрилл в нем.
Саркомер — последовательный компонент миофибриллы, состоит из нитей актина и миозина. Из миозина выходят веточки с головками. Головка миозина является одновременно ферментом для разрушения молекул АТФ и КрФ. При разрушении молекулы АТФ образуется АДФ, Ф, Н и энергия. Для ресинтеза молекулы АТФ нужна энергия, она берется из молекулы КрФ, которая при разрушении преобразуется в свободный Кр, неорганический фосфат (Ф) и энергию.
Сокращение саркомера и миофибриллы возникает при выходе из цистерн кальция. Он прикрепляется к активным центрам актина и освобождает их для создания мостика между актином и миозином. Головка миозина, при прикреплении к актину, поворачивается на 45 градусов, что обеспечивает скольжение нитей по отношению друг к другу. Отрыв головки миозина от актина требует затраты энергии, которая берется из процесса разрушения молекулы АТФ ферментом — миозиновой АТФазой. Вслед за этим креатинфосфокиназа разрушает КрФ и энергия этой молекулы идет на ресинтез АТФ. Свободный креатин и неорганический фосфат проникает сквозь миофибриллу к митохондриям или ферментам гликолиза и приводят к запуску гликолиза и окислительному фосфорилированию.
Выход кальция из цистерн происходит при активации МВ. После прекращения электрической стимуляции МВ в цистернах закрываются поры, а кальциевые насосы продолжают закачивать атомы кальция в цистерны. Через 50–100 мс большая часть ионов кальция закачивается обратно в цистерны. Этот процесс называют расслаблением мышцы.
Молекулы АТФ крупные, поэтому очень медленно перемещаются по МВ. Посредником между миофибриллами и митохондриями по доставке энергии являются молекулы КрФ. Эти молекулы маленькие и легко перемещаются по МВ. Российские ученые (Сакс с соав., 1977) назвали этот механизм креатинфосфатным челноком.
Поэтому прием креатина с пищей позволяет повысить его концентрацию в МВ. В результате существенно ускоряются метаболические процессы в МВ.
Модель биоэнергетических процессов в мышечных волокнах разного типа
В гликолитических мышечных волокнах имеется запас молекул АТФ в миофибриллах, запас молекул АТФ около митохондрий, запас молекул АТФ в саркоплазме. Имеется запас молекул КрФ, глобул гликогена и капелек жира. Масса митохондрий в гликолитических МВ (ГМВ) мала, поскольку необходима только для жизни этих клеток в покое.
Активизация биохимических процессов начинается с момента прохождения электрических импульсов по мембранам МВ. Открываются поры в цистернах, выходит кальций в саркоплазму, кальций прикрепляется к актину, образуются актин-миозиновые мостики, тратится АТФ и КрФ. Свободный креатин и неорганический фосфат выходят из миофибрилл и используют энергию саркоплазматических молекул АТФ для ресинтеза КрФ. Молекулы АТФ ресинтезируются в ходе анаэробного гликолиза. Гликолиз начинается с разрушения молекулы глюкозы или гликогена, а заканчивается образованием пирувата. Пируват, из-за отсутствия митохондрий, преобразуется в лактат. Соединение аниона лактата с протоном водорода приводит к образованию молочной кислоты, которая может в таком виде выходить в кровь. В крови молекула молочной кислоты диссоциирует, поэтому между концентрацией водорода и лактата имеется высокая корреляционная связь (R = 0,99).
Ионы водорода образуются при распаде саркоплазматических и других молекул АТФ.
Активность ГМВ приводит к накоплению в саркоплазме продуктов метаболизма Н, Кр, Ф, Ла, Пир и др.
Запасов миофибриллярных АТФ хватает на 1–2 с, КрФ 5–20 с (в зависимости от режима сокращения и расслабления МВ). Затем усиливается гликолиз, но мощность его не более 50 % от максимума, а из-за накопления ионов водорода нарушается процесс образования актин-миозиновых мостиков и через 30 с они практически полностью перестают образовываться. Это явление обычно определяют как локальное мышечное утомление. ГМВ определяют как утомляемые мышечные волокна.
Окислительные мышечные волокна устроены точно также как и гликолитические мышечные волокна. Основное различие связано с массой митохондрий. В ОМВ масса митохондрий находится в предельном соотношении с миофибриллами, что обеспечивает максимальное потребление кислорода одним килограммом ОМВ около 0,3 л/мин.
Активизация ОМВ приводит к образованию актин — миозиновых мостиков и затратам энергии молекул АТФ. Концентрация миофибриллярных молекул АТФ поддерживается КрФ. Поддержание концентрации КрФ обеспечивается двумя путями:
— молекулами АТФ ресинтезируемыми в митохондриях,
— молекулами АТФ ресинтезируемыми в аэробном гликолизе.
Этот процесс развивается в течение 45–60 с. К этому времени одновременно может идти как гликолиз, так и окисление жиров. Но по мере функционирования митохондрий в саркоплазме накапливается цитрат, поэтому начинается ингибирование ферментов гликолиза и ОМВ полностью переходит на липолиз.
Липолиз использует запасы жира в капельках, запаса этого жира у нормальных людей хватает на 30–50 мин. Жирные кислоты крови медленно поступают в МВ, поэтому не могут полностью обеспечить мышечную деятельность высокой интенсивности.
Митохондрии поглощают АДФ, Ф, кислород, пируват, жирные кислоты, глицерол, ионы водорода и выделяют ресинтезированные молекулы АТФ, углекислый газ и воду. Поэтому ОМВ не закисляются, не утомляются.
Окисление жиров в ОМВ может прекратиться, если в саркоплазме появятся ионы лактата. В этом случае окисление жиров ингибируется, а лактат становится субстратом окисления. Лактат с помощью лактатдегидрогеназы сердечного типа превращается в пируват, а тот, через ацетил-коэнзима, поступает в митохондрии. Пируват также начинает образовываться в ходе гликолиза из глюкозы и гликогена.
Лактат может попасть в ОМВ только при одновременном функционировании ГМВ и ОМВ.
Биомеханические свойства мышечных волокон связаны с эмпирическими законами:
— «сила — длина»,
— «сила — скорость»,
— «сила — время активации»,
— «сила — время расслабления»,
— «сила — энергия упругой деформации».
Эти законы надо учитывать при анализе соревновательной деятельности.
Нервно-мышечный аппарат
Сердце и кровообращение
Деятельность сердца и сосудов обеспечивает кровообращение — непрерывное движение крови в организме. В своем движении кровь проходит по большому и малому кругам кровообращения. Большой круг начинается от левого желудочка сердца, включает аорту, отходящие от нее артерии, артериолы, капилляры, вены и заканчивается полыми венами, впадающими в правое предсердие. Малый круг кровообращения начинается от правого желудочка, далее — легочная артерия, легочные артериолы, капилляры, вены, легочная вена, впадающая в левое предсердие.
Функцией сердца является ритмическое нагнетание в артерии крови. Сокращение мышечных волокон (миокардиоцитов) стенок предсердий и желудочков называют систолой, а расслабление — диастолой.
Количество крови, выбрасываемое левым желудочком сердца в минуту, называется минутным объемом кровотока (МОК). В покое он составляет в норме 4–5 л/мин. Разделив МОК на частоту сердечных сокращений в минуту (ЧСС), можно получить ударный объем кровотока или сердца (УОС). В покое он составляет 60–70 мл крови за удар.
Частота и сила сокращений зависит от нервной, гуморальной (адреналин) регуляции и биомеханических условий работы желудочков.
При вертикальном положении тела имеется механический фактор — сила тяжести крови, затрудняющий работу сердца, приток венозной крови к правому предсердию. В нижних конечностях скапливается до 300–800 мл крови.
При мышечной работе минутный объем кровотока растет за счет увеличения ЧСС и УОС. Заметим, что УОС достигает максимума при ЧСС 120–150 уд/мин, а максимум ЧСС бывает при 180–200 и более уд/мин. МОК достигает 18–25 л/мин у нетренированных лиц при достижении максимальной ЧСС (Физиология мышечной деятельности, 1982). В этот момент сердце доставляет организму максимум кислорода:
VO2 = МОК×Нв×0,00134 = 20×160×0,00134 = 4,288 л/мин
Здесь Нв — содержание гемоглобина в крови, г/л крови; 0,00134 — кислородная емкость гемоглобина в артериальной крови.
Если бы мышцы нетренированного человека могли бы полностью использовать весь приходящий кислород, то этот человек мог бы стать мастером спорта по бегу на длинные дистанции (бегуны мирового класса потребляют кислород на уровне анаэробного порога 4,0–4,5 л/мин). Однако, в мышцах мало митохондрий, поэтому максимальное потребление кислорода (МПК) у нетренированного мужчины составляет 3–3,5 л/мин (45–50 мл/кг/мин), у нетренированной женщины — 2–2,2 л/мин (40–45 мл/кг/мин). На уровне анаэробного порога потребление кислорода составляет в среднем 60–70 % МПК, что в 2 раза меньше, чем у мастеров спорта (Аулик И. В., 1990; Спортивная физиология, 1986).
Кровеносные сосуды
Сердце при сокращении (систоле) выталкивает кровь в аорту и легочную артерию, растягивая их и создавая давление крови (Р). Движению крови препятствует сосудистое (периферическое) сопротивление. Максимальное давление называется систолическим артериальным давлением (САД), минимальное — диастолическим артериальным давлением (ДАД). В условиях покоя в норме САД = 120 мм рт. ст., ДАД = 80 мм рт. ст. Между растяжимостью (эластичностью) артерий и давлением крови в сосудах имеется обратная зависимость. Чем растяжимее артерии, тем больше крови может быть нагнетено без увеличения артериального давления (АД). При артериосклерозе стенка аорты менее эластична, поэтому надо сильнее нагнетать кровь (тот же объем крови, как у здорового человека), чтобы она дальше прошла по сосудам. Сопротивление кровотоку зависит от вязкости крови и, главным образом, от просвета сосудов. Увеличение напряжения мышц вызывает перекрытие сосудов — увеличение сосудистого сопротивления. Накопление в крови мышц продуктов анаэробных процессов (рН, рСО2, уменьшение рО2 и др. ) приводит к рабочей гиперемии — расширению кровеносных сосудов, т. е. уменьшению АД (Физиология мышечной деятельности, 1981).
Нервный контроль и гуморальный наиболее важны в управлении функциями сосудистой системы. Симпатические нервные волокна иннервируют гладкие мышцы в стенках артериальных и венозных сосудов, особенно мелких. Кровоток через капилляры определяется местными факторами.
Сосудосуживающий эффект связан с выделением из окончаний адренэргических симпатических волокон норадреналина, который вызывает эффект сокращения гладкомышечных сосудистых клеток, имеющих альфа-рецепторы на мембране (почки, печень, желудочно-кишечный тракт, легкие, кожа). Сосудорасширительный эффект (вазодилятацию) вызывает действие норадреналина и адреналина на гладкомышечные клетки, имеющие бета-рецепторы (сосуды скелетных мышц, сердца, надпочечников) (Физиология человека, 1998).
Реакция организма спортсмена на упражнения разной интенсивности
Каждый спортсмен может себя протестировать, участвуя в соревнованиях на различные дистанции. Зная скорость бега и время можно построить график личных рекордов. Если ось времени представлена как логарифм от времени, то получается график из двух прямых. Первая прямая характеризует максимальные скоростно-силовые способности, вторая — наклонная прямая, характеризует аэробные возможности спортсмена.
Таким образом, никаких 4 или 5 зон мощности у отдельных спортсменов нет, поэтому классическое представлении о зонах мощности на кривой мировых рекордов является ошибочным. На полулогарифмическом графике мировых рекордов по легкой атлетике можно видеть четыре прямые соответствующие 4 лучшим спортсменам мира, т. е. каждый прямолинейный отрезок представляет индивидуальную кривую рекордов. Первая — спринтеров, вторая бегунов на средние дистанции, третья — бегунов на длинные дистанции и четвертая — марафонцев.
Креатинкиназа общая
Креатинкиназа – фермент, который стимулирует превращение креатина в креатинфосфат и обеспечивает энергией мышечное сокращение.
Синонимы русские
КК, креатинфосфокиназа (КФК).
Синонимы английские
Creatine Kinase (CK), Creatine Phosphokinase (CPK).
Метод исследования
УФ кинетический тест.
Единицы измерения
Ед/л (единица на литр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Венозную кровь.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Не принимать пищу в течение 12 часов перед исследованием.
- Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Креатинкиназа – это фермент, который катализирует реакцию переноса фосфорильного остатка с АТФ на креатин с образованием креатинфосфата и АДФ. АТФ (аденозинтрифосфат) – молекула, являющаяся источником энергии в биохимических реакциях человеческого организма.
Реакция, катализируемая креатинкиназой, обеспечивает энергией мышечные сокращения. Различают креатинкиназу, содержащуюся в митохондриях и цитоплазме клеток.
Молекула креатинкиназы состоит из двух частей, которые могут быть представлены одной из двух субъединиц: М, от английского muscle – «мышца», и B, brain – «мозг». Таким образом, в организме человека креатинкиназа есть в виде трех изомеров: ММ, МВ, ВВ. ММ-изомер содержится в скелетной мускулатуре и миокарде, МВ – в основном в миокарде, ВВ – в тканях головного мозга, в небольшом количестве в любых клетках организма.
В крови здорового человека креатинкиназа присутствует в небольших количествах, в основном в виде ММ-изомера. Активность креатинкиназы зависит от возраста, пола, расы, мышечной массы и физической активности.
Поступление креатинкиназы в кровоток в больших количествах происходит при повреждении содержащих ее клеток. При этом по повышению активности определенных изомеров можно сделать вывод о том, какая ткань поражена: ММ-фракция – повреждение мышц и в меньшей степени поражение сердца, МВ-фракция – повреждение миокарда, ВВ-фракция – онкологические заболевания. Обычно делают анализы на общую креатинкиназу и ее МВ-фракции.
Таким образом, повышение креатинкиназы в крови позволяет сделать вывод об опухолевом процессе, поражении сердца или мышц, которое в свою очередь может развиться как при первичном повреждении данных органов (при ишемии, воспалении, травмах, дистрофических процессах), так и вследствие их поражения при других состояниях (из-за отравления, метаболических нарушений, интоксикаций).
Сердечные заболевания, при которых разрушаются клетки, – это инфаркт миокарда, миокардиты, миокардиодистрофии, токсическое поражение миокарда. Анализ на креатинкиназу имеет наибольшее значение для диагностики инфаркта миокарда, так как активность этого фермента повышается раньше других, уже через 2-4 часа после инфаркта, и достигает максимума через 1-2 суток, затем нормализуется. Чем раньше начато лечение инфаркта, тем лучше для пациента, поэтому так важна своевременная и точная диагностика.
Заболевания мышц, при которых разрушаются клетки, – это миозиты, миодистрофии, травмы, особенно при сдавливании, пролежни, опухоли, интенсивная работа мышц, в том числе происходящая при судорогах. Кроме того, отмечена обратная зависимость уровня гормонов щитовидной железы и креатинкиназы: при снижении T3 и T4 активность креатинкиназы повышается и наоборот.
Интересно, что впервые анализ на креатинкиназу был использован для выявления миопатии, однако в настоящее время его используют главным образом для диагностики инфаркта миокарда.
Для чего используется исследование?
- Для подтверждения диагноза «инфаркт миокарда», «миокардит», «миокардиодистрофия».
- Для подтверждения диагноза «полимиозит», «дерматомиозит», «миодистрофия».
- Чтобы проверить наличие заболеваний щитовидной железы.
- Чтобы убедиться в наличии опухолевого процесса и оценить его тяжесть.
- Чтобы оценить тяжесть течения полимиозита, дерматомиозита, миодистрофии, миопатии.
- Чтобы выявить носительство гена миопатии Дюшенна.
- Для диагностики и оценки тяжести поражения сердца и мышечной системы при интоксикации из-за инфекции, а также при отравлениях (угарным газом, ядом змеи, лекарственными средствами).
Когда назначается исследование?
- При симптомах ишемической болезни сердца.
- При симптомах инфаркта миокарда, в частности при стертой клинической картине, особенно при повторном инфаркте, атипичной локализации, болевом синдроме или ЭКГ-признаках, затруднении дифференциальной диагностики с другими формами ишемической болезни сердца.
- При гипотиреозе.
- При симптомах миозита, миодистрофии, миопатии.
- При планировании беременности женщиной, в семье которой были больные миопатией Дюшенна.
- При заболеваниях, которые могут привести к поражению сердца или мышечной системы.
Что означают результаты?
Референсные значения
Возраст, пол |
Референсные значения |
|
2 — 5 дней |
||
5 дней — 6 мес. |
||
6 — 12 мес. |
||
1 — 3 года |
||
3 — 6 лет |
||
6 — 12 лет |
женский |
|
мужской |
||
12 — 17 лет |
женский |
|
мужской |
||
> 17 лет |
женский |
|
мужской |
Результаты анализа говорят о наличии или отсутствии поражения миокарда, скелетной мускулатуры, опухолевого процесса, заболеваний щитовидной железы. Верная трактовка полученных показателей позволяет сделать вывод о форме поражения и степени его тяжести.
Причины повышения активности креатинкиназы общей:
- инфаркт миокарда,
- миокардиты,
- миокардиодистрофии,
- полимиозит,
- дерматомиозит,
- мышечные дистрофии,
- травмы, ожоги,
- гипотиреоз,
- опухолевый процесс в организме,
- распад опухоли,
- прием дексаметазона, статинов, фибратов, амфотерицина В, обезболивающих, алкоголя, кокаина,
- интенсивная физическая нагрузка,
- судороги, эпилептический статус,
- оперативные вмешательства.
Причины понижения активности креатинкиназы общей:
- снижение мышечной массы,
- алкогольное поражение печени,
- коллагенозы (например, ревматоидный артрит),
- гипертиреоз,
- прием аскорбиновой кислоты, амикацина, аспирина,
- беременность.
Что может влиять на результат?
- Необходимо сообщать врачу точную информацию о принимаемых лекарствах, а также об имеющихся хронических заболеваниях.
- Оперативные вмешательства и в некоторых случаях внутривенные инъекции повышают активность креатинкиназы.
Важные замечания
Повышение активности креатинкиназы общей не является прямым указанием на какое-либо заболевание, так что оно должно трактоваться специалистом с учетом клинической картины и результатов дополнительного обследования.
Также рекомендуется
Кто назначает исследование?
Кардиолог, терапевт, невролог, педиатр, онколог, эндокринолог.
Литература
- Пархоменко А. Н., Иркин О. И., Лутай Я. М. – Роль биологических маркеров в неотложной кардиологии. – Отдел реанимации и интенсивной терапии, Национальный научно-исследовательский центр «Институт кардиологии им. акад. Н.Д. Стражеско», Киев.
- B. Galarraga, D. Sinclair 1 , M. N. Fahie, F. C. McCrae, R. G. Hull and J. M. Ledingham. – A rare but important cause for a raised serum creatine kinase concentration: two case reports and a literature review.
- Ana L Huerta-Alardín, Joseph Varon and Paul E Marik. – Bench-to-bedside review: Rhabdomyolysis – an overview for clinicians.
- Archana Prakash, A. K. Lal, K. S. Negi. – Serum Creatine Kinase Activity in Thyroid Disorders.
- SourceClinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd edition. Boston: Butterworths; 1990. Chapter 32.
Аденозинтрифосфат — это… Что такое Аденозинтрифосфат?
Аденозинтрифосфа́т (сокр. АТФ, англ. АТР) — нуклеотид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. АТФ был открыт в 1929 году Карлом Ломанном[1], а в 1941 году Фриц Липман показал, что АТФ является основным переносчиком энергии в клетке[2].
Химические свойства
Структура аденозинтрифосфорной кислотыСистематическое наименование АТФ:
- 9-β-D-рибофуранозиладенин-5′-трифосфат, или
- 9-β-D-рибофуранозил-6-амино-пурин-5′-трифосфат.
Химически АТФ представляет собой трифосфорный эфир аденозина, который является производным аденина и рибозы.
Пуриновое азотистое основание — аденин — соединяется β-N-гликозидной связью с 1′-углеродом рибозы. К 5′-углероду рибозы последовательно присоединяются три молекулы фосфорной кислоты, обозначаемые соответственно буквами: α, β и γ.
АТФ относится к так называемым макроэргическим соединениям, то есть к химическим соединениям, содержащим связи, при гидролизе которых происходит освобождение значительного количества энергии. Гидролиз макроэргических связей молекулы АТФ, сопровождаемый отщеплением 1 или 2 остатков фосфорной кислоты, приводит к выделению, по различным данным, от 40 до 60 кДж/моль.
- АТФ + H2O → АДФ + H3PO4 + энергия
- АТФ + H2O → АМФ + H4P2O7 + энергия
Высвобожденная энергия используется в разнообразных процессах, протекающих с затратой энергии.
Роль в организме
Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Всё это реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного переноса молекул через биологические мембраны, в том числе и для создания трансмембранного электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения.
Помимо энергетической АТФ выполняет в организме ещё ряд других не менее важных функций:
- Вместе с другими нуклеозидтрифосфатами АТФ является исходным продуктом при синтезе нуклеиновых кислот.
- Кроме того, АТФ отводится важное место в регуляции множества биохимических процессов. Являясь аллостерическим эффектором ряда ферментов, АТФ, присоединяясь к их регуляторным центрам, усиливает или подавляет их активность.
- АТФ является также непосредственным предшественником синтеза циклического аденозинмонофосфата — вторичного посредника передачи в клетку гормонального сигнала.
- Также известна роль АТФ в качестве медиатора в синапсах.
Пути синтеза
В организме АТФ синтезируется путём фосфорилирования АДФ:
- АДФ + H3PO4 + энергия → АТФ + H2O.
Фосфорилирование АДФ возможно двумя способами: субстратное фосфорилирование и окислительное фосфорилирование (используя энергию окисляющихся веществ). Основная масса АТФ образуется на мембранах митохондрий в ходе окислительного фосфорилирования H-зависимой АТФ-синтазой. Субстратное фосфорилирование АТФ не требует участия мембранных ферментов, оно происходит в процессе гликолиза или путём переноса фосфатной группы с других макроэргических соединений.
Реакции фосфорилирования АДФ и последующего использования АТФ в качестве источника энергии образуют циклический процесс, составляющий суть энергетического обмена.
В организме АТФ является одним из самых часто обновляемых веществ, так у человека продолжительность жизни одной молекулы АТФ менее 1 мин. В течение суток одна молекула АТФ проходит в среднем 2000—3000 циклов ресинтеза (человеческий организм синтезирует около 40 кг АТФ в день), то есть запаса АТФ в организме практически не создаётся, и для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянно синтезировать новые молекулы АТФ.
См. также
Примечания
- ↑ Lohmann, K. (1929) Über die Pyrophosphatfraktion im Muskel. Naturwissenschaften 17, 624—625.
- ↑ Lipmann F. (1941) Adv. Enzymol. 1, 99-162.
Литература
- Voet D, Voet JG. Biochemistry Vol 1 3rd ed.. — Wiley: Hoboken, NJ.. — ISBN 978-0-471-19350-0
- Lodish, H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J. Molecular Cell Biology, 5th ed.. — New York: WH Freeman, 2004. — ISBN 9780716743668
Биологические молекулы • Джеймс Трефил, энциклопедия «Двести законов мироздания»
Жизнь — таинственная, сложная, загадочная — не что иное как совокупность достаточно крупных молекул и довольно простых химических реакций. Если бы вам понадобилось конструировать крупные молекулы, вы пошли бы по одному из двух путей. Либо, как в кустарном ювелирном деле, вы стали строить каждую молекулу «с нуля», проделывая каждый раз уникальную работу. Либо — этот путь используется в современных строительных технологиях — вы бы изготовили набор простых молекул, из которых можно собирать самые разнообразные молекулы большего размера, сочетая модули тем или иным образом. Оказывается, именно такое модульное строение имеют биологические молекулы. Согласно теории эволюции, таким и должен был быть самой простой путь к крупным молекулам, поскольку в начале эволюционного процесса необходимость в конструировании очень сложных молекул отсутствовала. Со временем же могли добавляться новые модули, расширяя коллекцию крупных разнородных элементов, что вполне соответствует духу эволюции.
Белки
Основной структурной единицей белков являются молекулы аминокислот. Чтобы понять, что такое аминокислота, представьте себе совокупность атомов, у которых с одной стороны наружу выступает водород, с другой — соединенные между собой кислород и водород, а посередине расположены разнообразные другие компоненты. Подобно тому как бусины нанизываются на нить, из этих аминокислот собираются белки — ион водорода (Н+) одной аминокислоты объединяется с ионом гидроксила (ОН–) другой аминокислоты с образованием молекулы воды. (Представьте, как каждый раз при соединении двух аминокислотных молекул между ними пробегает капелька воды.) Среди белков самую важную роль играют белки-ферменты (см. Катализаторы и ферменты), регулирующие химические реакции в клетках; но белки также являются важными структурными компонентами живых организмов. Например, ваши волосы и ногти состоят из белков.
Углеводы
Углеводы содержат кислород, водород и углерод в соотношении 1:2:1. Во многих живых системах молекулы углеводов выполняют роль источников энергии. Одним из важнейших углеводов можно считать сахар глюкозу, содержащую шесть атомов углерода (С6Н12О6). Глюкоза — конечный продукт фотосинтеза и, следовательно, основа всей пищевой цепи в биосфере. Соединяя молекулы глюкозы, как основные строительные модули, можно получить сложные углеводы. Как и белки, углеводы играют вспомогательную роль в клетках, поскольку входят в клеточные структуры. Например, растительные волокна состоят из целлюлозы, которая представляет собой вереницу сцепленных особым образом молекул глюкозы.
Липиды
Липиды — это нерастворимые в воде органические молекулы. Вы получите правильное представление о липидах, если вообразите капельки жира, плавающие на поверхности бульона. В живых организмах липиды выполняют две важные функции. Один класс молекул — фосфолипиды — состоят из маленькой головки, содержащей фосфатную группу (атом фосфора, соединенный с четырьмя атомами кислорода), и длинного углеводородного хвоста. Углеводородный хвост этой молекулы гидрофобен, то есть энергетическое состояние молекулы минимально, когда этот хвост находится не в воде. Напротив, фосфатная головка гидрофильна, то есть энергетическое состояние молекулы минимально при контакте головки с водой . Если поместить молекулы фосфолипидов в воду, они будут стремиться достичь минимального энергетического состояния и выстроятся таким образом, что их хвосты окажутся вместе, а головки — врозь. Такая двухслойная структура очень стабильна, поскольку головки будут в контакте с водой, но вода будет вытеснена из области, окружающей хвосты молекул. Для перемещения липидным молекулам необходима энергия — либо чтобы удалить гидрофильные участки из воды, либо чтобы поместить в воду гидрофобные участки. Из таких липидных двухслойных структур состоят клеточные мембраны и мембраны, разделяющие компоненты клетки. Эти пластичные и прочные молекулы отделяют живое от неживого.
Кроме того, в липидах запасается энергия. Липиды могут накапливать примерно вдвое больше энергии на единицу массы, чем углеводы. Вот почему, когда вы переедаете и ваш организм хочет запасти энергию на случай непредвиденных обстоятельств в будущем, когда пищи не будет, он станет запасать ее в форме жира. На этом простом факте строится многомиллиардная индустрия диетических продуктов.
Нуклеиновые кислоты
Молекулы ДНК и РНК (см. Центральная догма молекулярной биологии) переносят информацию о химических процессах, идущих в клетке, и участвуют в передаче содержащейся в ДНК информации в цитоплазму клетки. В ДНК живого организма закодированы белки-ферменты, которые катализируют все химические реакции, происходящие в этом организме.
Молекулы-переносчики энергии
Жизнедеятельность требует затрат энергии. В частности, нужно, чтобы энергия, произведенная в одном месте, могла быть использована в другом. Эту функцию в клетке осуществляет целая армия специализированных молекул. Пожалуй, самые важные из них — аденозин трифосфат (АТФ) и аденозин дифосфат (АДФ). Обе молекулы устроены так: группа из атомов углерода, водорода и азота (она называется аденин) присоединена к молекуле рибозы (это сахар), и все это вместе крепится к хвосту из фосфатов. Из названий молекул понятно, что в хвосте АДФ содержится два фосфата, а в хвосте АТФ — три. Когда в клетке происходит химический процесс, например фотосинтез, образующаяся энергия идет на присоединение третьего фосфата к хвосту АДФ. Полученная молекула АТФ затем переносится в другие части клетки. Там запасенная энергия может быть использована в других химических процессах: она выделяется при отщеплении последнего фосфата от АТФ, в результате чего АТФ вновь превращается в АДФ.
Как мы уже упоминали, существуют и другие молекулы, которые переносят энергию в клетке. Набор таких молекул чем-то напоминает разные варианты оплаты счетов. Вы можете выбрать наличные, банковский перевод, кредитную карту и т. д. — в зависимости от того, какой способ вам удобнее. Так же и клетка для поддержания своей жизнедеятельности может использовать АТФ (эквивалент наличных денег) или любую другую из большого набора более сложных молекул.
См. также:
Функциональный ключ | Позиция (я) | Описание Действия | Графическое представление | Длина |
---|---|---|---|---|
В этом подразделе раздела «PTM / Обработка» описывается протяженность полипептидной цепи в зрелом белке после процессинга или протеолитического расщепления. Цепочка i PRO_0000076577 | 1-505 | Циклический AMP-зависимый фактор транскрипции ATF-2 Добавить BLAST | 505 | |
Функциональный ключ | Позиция (я) | Описание Действия | Графическое изображение | Длина |
В этом подразделе раздела «PTM / Обработка» указываются положение и тип каждого измененного остатка, за исключением lipids , гликаны и перекрестные ссылки протеина . Подробнее … p > Модифицированный остаток i | 52 | Фосфотреонин; по PKC / PRKCH Ручное утверждение на основе эксперимента в i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 62 | Фосфосерин; по VRK1 Подтвержденная вручную информация, полученная на основе экспериментальных и расчетных данных. Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и расчетных данных iРучное утверждение, основанное на эксперименте в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 69 | Фосфотреонин; by MAPK11 и MAPK14 Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и вычислительных данных i
Ручное утверждение на основе эксперимента в i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 71 | Фосфотреонин; по MAPK1, MAPK3, MAPK11, MAPK12, MAPK14 и PLK3 Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и расчетных данных i
Ручное утверждение на основе эксперимента в i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 73 | Фосфотреонин; по VRK1 Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 90 | Фосфосерин Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и компьютерных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 112 | Фосфосерин Утверждение, сделанное вручную на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 116 | Фосфотреонин Ручное утверждение, сделанное на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 121 | Фосфосерин; от PKC / PRKCA и PKC / PRKCB Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 136 | Фосфосерин Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и компьютерных данных i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 328 | Фосфосерин Утверждение, сделанное вручную на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 340 | Фосфосерин; by PKC / PRKCA и PKC / PRKCB Ручное утверждение на основе эксперимента в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 357 | N6-acetyllysine Ручное утверждение на основе эксперимента в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 367 | Фосфосерин; by PKC / PRKCA и PKC / PRKCB Ручное утверждение на основе эксперимента в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 374 | N6-acetyllysine Ручное утверждение на основе эксперимента в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 442 | Фосфосерин Утверждение, сделанное вручную на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 446 | Фосфосерин Утверждение, сделанное вручную на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных i
| 1 | |
Модифицированный остаток i | 490 | Фосфосерин; через банкомат Ручное утверждение на основе эксперимента в i | 1 | |
Модифицированный остаток i | 498 | Фосфосерин; by ATM Ручное утверждение на основе эксперимента i | 1 |
Перфузионная культура с удержанием клеток ATF
Преимущества культуры перфузионных клеток
Перфузионные процессы имеют много преимуществ.Например, они помогают защитить качество продукции. Кроме того, они поддерживают эффективное использование оборудования, предлагая возможность использования биореакторов меньшего размера. По сравнению с периодическим или периодическим процессами с подпиткой, культура перфузионных клеток позволяет клеткам оставаться в фазе экспоненциального роста в течение длительного времени и достигать более высокой плотности жизнеспособных клеток.
Варианты удержания клеток
Для перфузионных культур доступно несколько методов удержания клеток. Один из них — тангенциальная фильтрация потока (TFF).В отличие от нормальной проточной фильтрации (NFF), при которой среда прокачивается через мембранный фильтр, перистальтический насос используется для рециркуляции супернатанта клеточной культуры по проницаемой поверхности мембраны. Этот процесс снижает риск загрязнения фильтра. В TFF жидкость и соединения с молекулярной массой меньше, чем предел мембраны, могут проходить через мембрану (пермеат), тогда как более крупные молекулы задерживаются (ретентат). Для фильтрации с попеременным тангенциальным потоком (ATF) используется метод TFF, но диафрагменный насос меняет направление потока по поверхности мембраны.
Перфузия в качающихся биореакторах и биореакторах с мешалкой
В предыдущей работе перфузионные культуры проводились в качающихся биореакторах с использованием ATF или TFF в качестве метода удержания клеток. Сходный рост клеток и продуктивность были достигнуты обоими методами (1, 2). Текущее исследование показывает перфузионную культуру, проводимую в одноразовой системе биореактора с мешалкой XDR-10 (рис. 1), с использованием ATF для удержания клеток. Целями процесса были плотности клеток выше 25 × 10 6 клеток / мл, специфическая для клеток скорость перфузии (CSPR) в пределах 25–40 мкл / клетка / день и постоянная перфузия в течение минимум пяти дней.
Подробные материалы и методы представлены внизу статьи.
Рис. 1. Одноразовая биореакторная система с мешалкой XDR-10.
Результаты с использованием ATF в качестве метода удержания клеток
Схема перфузии для метода удержания клеток ATF показана на рисунке 2.
Рисунок 2. Схема перфузии с биореакторной системой XDR-10 с использованием ATF в качестве метода удержания клеток .
В установке ATF пиковая плотность клеток 47 × 10 6 клеток / мл была достигнута на 6-й день (рис. 3), когда началось кровотечение культуры.
Рис. 3. Рост и жизнеспособность клеток для перфузионной культуры с использованием ATF в качестве метода удержания клеток. C t и C v представляют собой общую и жизнеспособную плотность клеток соответственно.
Датчик Incyte, измеряющий VCD, использовался для отслеживания роста клеток в линии при культивировании ATF. Датчик VCD также можно использовать для автоматического обескровливания культур, чтобы они оставались здоровыми. Был достигнут средний CSPR 30 мкл / клетка / день. Среднее объемное производство было 0.38 г / л / сут в течение семи дней стабильной перфузии (рис. 4). Признаков загрязнения фильтра во время процесса не наблюдалось.
Рис. 4. Клеточно-специфическая скорость перфузии (CSPR), титр продукта и объем сосудов в день (VVD) для перфузионной культуры с использованием ATF в качестве метода удержания клеток.
Обсуждение
Эти результаты показывают, что перфузионное культивирование может успешно проводиться в одноразовой биореакторной системе XDR-10 с использованием TFF в качестве метода удержания клеток. В конечном итоге характеристики выбранной среды и клеточной линии будут играть важную роль в производительности процесса.Кроме того, на производительность процесса существенно влияют площадь и размер пор выбранного фильтра. Здесь система биореактора была подключена к одноразовому фильтрующему элементу через одноразовую трубку. Для полностью одноразовых решений в установках могут использоваться одноразовые насосные системы. Одноразовое оборудование устраняет необходимость в очистке и соответствующей проверке, сокращая время настройки и переналадки. Одноразовое оборудование также минимизировало риск перекрестного загрязнения, так как все компоненты процесса, которые контактируют с обрабатываемым материалом, включая картридж фильтра, могут быть удобно утилизированы после использования без необходимости открытого обращения.Картриджи для фильтров из полых волокон ReadyToProcess использовались для удержания клеток. Они особенно подходят для процессов, в которых технологический поток должен быть ограничен по соображениям здоровья и безопасности.
Заключение
Эта работа описывает установку процесса перфузии с использованием ATF в качестве метода удержания клеток. Аналогичное исследование было выполнено с использованием TFF в качестве метода удержания клеток. В обеих установках использовались биореакторная система XDR-10 и картридж из полых волокон с площадью фильтрации 990 см. 2 , которые различались только блоком удержания клеток.Хотя засорение фильтра было немного быстрее с TFF по сравнению с настройкой ATF, результаты показывают сопоставимую производительность между двумя настройками.
Прочтите сопутствующую статью о настройке перфузионного биореактора XDR-10 с методом удержания клеток TFF.
Узнайте больше о решениях для биотехнологической обработки от Cytiva.
Ссылки
- Clincke, M. F. et al. Очень высокая плотность клеток СНО при перфузии с помощью ATF или TFF в биореакторе WAVE. Часть I: Влияние плотности клеток на процесс. Biotechnol. Прог. 29, 754–767 (2013).
- Clincke, M. F. et al. Очень высокая плотность клеток яичника китайского хомячка в перфузии за счет чередования тангенциального потока или фильтрации тангенциального потока в биореакторе WAVE. Часть II: Приложения для производства антител и криоконсервации. Biotechnol. Прог. 29, 768–777 (2013).
- Xu, S. et al. Влияние Pluronic ™ F68 на характеристики перфузионных культур на основе половолоконных фильтров. Биопроцесс Биосист. Англ. 40, 1317–1326 (2017).
Информация для заказа
ATF — Twin Specialties Corp.
Что такое модификаторы трения?
Модификаторы трения — это мягкие противоизносные присадки, используемые для минимизации легкого контакта с поверхностью, такого как скольжение и качение. Их также можно назвать присадками для граничной смазки. Эти присадки используются в смазочных материалах для изменения коэффициента трения (отсюда и название «Модификаторы трения»).Модификаторы трения используются для предотвращения износа металлических поверхностей. Эти присадки, в основном используемые в трансмиссионных жидкостях и моторных маслах, помогают замедлить износ и повысить экономию топлива.
Как работают модификаторы трения?
Источник: Machinery Lubrication — NoriaМолекула модификатора трения состоит из двух частей: полярного конца (голова) и маслорастворимого конца (хвоста). Головка прикрепляется к металлической поверхности, чтобы создать подушку для металлической поверхности против другой металлической поверхности.Хвосты встают, как ковер; вертикально уложенные друг на друга в листе наноразмеров, покрывающем металлическую поверхность. Эти молекулы удерживаются, когда мягкие поверхности слегка соприкасаются друг с другом. Это образует толстую пограничную пленку, более мягкую, чем металлические поверхности.
Эти добавки имеют несколько функций, помимо модификации трения. Они также действуют как антиоксиданты и ингибиторы коррозии. По мере того, как контакт или нагрузка становятся более тяжелыми, полярные молекулы смахиваются, что делает добавку бесполезной для уменьшения трения.
Применение модификатора трения
Модификаторы трения обычно используются в моторных маслах и жидкостях для автоматических трансмиссий. В моторных маслах используются модификаторы трения для повышения экономии топлива за счет уменьшения трения. В трансмиссионных жидкостях используются модификаторы трения для улучшения зацепления сцепления. В некоторых ситуациях для правильной работы требуется некоторая тяга.
Их использование в моторных смазках увеличилось в 1970-х годах из-за нефтяного эмбарго. Нехватка топлива привела к тому, что автомобильная промышленность повысила экономию топлива, тем самым уменьшив расход топлива.Постоянное развитие привело к созданию смазочных материалов с более низкой вязкостью. Теперь смазочные материалы требуют надежных модификаторов трения для уменьшения износа и трения, чтобы компенсировать более низкую вязкость.
Однако модификаторы трения в этих приложениях действуют по-разному в зависимости от условий сдвига. Это гарантирует, что оборудование не изнашивается, а также предотвращает чрезмерное проскальзывание. Это сглаживает переход от динамического состояния к статическому. Например, это используется при переключении передач в трансмиссии.
Присадки против износа и противозадирных (EP)
По мере увеличения нагрузки инженеры должны корректировать свой смазочный материал в соответствии с более жесткими требованиями к более тяжелым нагрузкам и более высоким температурам.Вам следует перейти на модификатор, который классифицируется как противоизносная присадка. Распространенным и эффективным средством против износа является диалкилдитиофосфат цинка (ZDDP). Эти добавки вступают в реакцию с металлическими поверхностями, когда окружающая среда достигает достаточно высокой температуры.
По мере увеличения нагрузок, помимо контакта с металлом, модификатор трения должен становиться более прочным. В этом случае ваша смазка должна содержать противозадирные присадки. Эти добавки либо зависят от температуры, либо нет.Температурно-зависимые противозадирные присадки активируются при повышении температуры поверхности металла из-за экстремального давления. Реакция вызвана теплом, возникающим при трении.
Последние мысли
Смазочные материалы с модификаторами трения создают более эффективную рабочую среду. Это приводит к меньшему износу, простоям и выбросам углекислого газа. По мере улучшения добавок модификаторов трения производители смазочных материалов будут стремиться к снижению вязкости, чтобы снизить условия сдвига. И наоборот, это создает больше компонентов, работающих в условиях тонкой граничной смазки.Мы будем наблюдать постоянное совершенствование этих добавок для удовлетворения требований к производительности и эффективности.
Примечание: для этого содержимого требуется JavaScript.Lubegard Technology — Lubegard
LXE® Technology
С 1984 года International Lubricants, Inc. является лидером в исследованиях, разработке и производстве запатентованных высокоэффективных синтетических смазочных материалов на основе сложных эфиров и сопутствующих товаров для автомобилей. , промышленное, морское и сельскохозяйственное применение.Здесь, во время предварительной разработки собственной технологии LXE, International Lubricants Inc. воспользовалась возможностью производить продукты, которые были бы более безопасными для окружающей среды, благоприятными по своему влиянию на пользователей и превосходными в решении многих общих проблем, связанных с жидкостями. .
Доктор Фил Лэндис, бывший глава исследовательской группы Mobil Oil Applied Lubrication, стал пионером в области трибологии в автомобильной промышленности, разработав технологию LXE, Liquid Wax Ester, Technology в качестве прямой молекулярной замены масла кашалота.
Почему масло кашалота?
Масло кашалота и его производные использовались в качестве добавок практически ко всем автомобильным смазочным материалам. Продукты были настолько эффективны, что жидкости в транспортных средствах, как правило, никогда не менялись, а такие системы, как трансмиссия, прослужили весь срок службы автомобиля. Только на смазку ежегодно расходуется около 30 миллионов фунтов кашалотового жира. Чтобы удовлетворить спрос, были выловлены сотни тысяч китов, что поставило этот вид на грань исчезновения.
В 1972 году Закон об исчезающих видах объявил убийство китов и использование материалов, полученных от этих животных, вне закона. В течение многих лет автомобильная промышленность при производстве моторных масел полагалась на другие продукты животного происхождения, такие как жир или сало. Для сложных систем, таких как трансмиссии, эти заменители оказались неадекватными, что привело к ухудшению общей производительности трансмиссии, преждевременному отказу трансмиссии и отказу из-за перегрева. Например, количество отказов автоматических трансмиссий увеличилось с менее миллиона единиц в 1972 году до более восьми миллионов единиц в год к 1975 году из-за потери присадок к маслу кашалота.По данным Ассоциации производителей автоматических трансмиссий в Вентуре, Калифорния, сегодня более 11 миллионов отказов автоматических трансмиссий в год (и почти девять из десяти) вызваны ухудшением качества жидкости для автоматической трансмиссии из-за нагрева. Тепло способствует окислению трансмиссионной жидкости, что ухудшает ее характеристики и ускоряет износ внутренних компонентов автоматических трансмиссий.
Состав LXE, прямой синтетический заменитель кашалотового жира
Жидкий восковой эфир (LXE®) был впервые разработан и запатентован как синтетический заменитель жира кашалота.LXE по структуре и характеристикам аналогичен натуральному кашалотовому маслу и является одной из крупнейших известных в мире сложноэфирных цепей. Синтетический сложный эфир имеет структуру, которая плотно связывает молекулы вместе, что позволяет течь при низких температурах, сохраняя при этом стабильность к окислению. Поскольку в нем очень мало ненасыщенности, он намного более стабилен, чем многие другие синтетические молекулы.
Итак, как именно производится LXE? Рад, что ты спросил.
LXE Technology основана на биологических веществах и состоит из жирных кислот с высоким содержанием эруковой кислоты, содержащих масло семян, этерифицированных дорогим и редким спиртом.Этот процесс требует, чтобы мы использовали эфирные масла высочайшей чистоты, с длинными жирными цепями триглицеридных сложноэфирных групп и с небольшой ненасыщенностью или без ненасыщенности (которая, если она присутствует, может привести к окислительной нестабильности).
В некоторых продуктах LUBEGARD с технологией LXE также используется фосфорный материал, в результате чего соединение вступает в реакцию с металлическими поверхностями и образует прочную связь, отлично подходящую для использования в качестве противоизносной присадки и модификатора трения, что также очень эффективно и действенно при низких скоростях скольжения. .
Органическое соединение серы также используется в различных продуктах.Это то, что придает характерный запах некоторым продуктам LUBEGARD. Комбинация фосфора и серы улучшает противоизносные свойства фосфора, обеспечивая дополнительную производительность и защиту. Сложные эфиры служат в качестве смазки и антиоксиданта, предотвращая реакцию воздуха с углеводородами и превращение их в шлам и грязь.
И, конечно же, молекула LXE и ее производные молекулы затем включаются в различные функциональные составы или продукты, которые идеально подходят для таких отраслей, как автомобилестроение, судостроение, энергетическое оборудование, по сути, любая моторизованная система, где тепло, окисление, износ и кислота накопление может произойти.
Достаточно интересно, что уникальная синтетическая технология LXE от ILI доказала свою эффективность по сравнению с присадками к маслу кашалота. Независимые испытания, проведенные лабораториями OEM-производителей жидкостей, показали, что технология LXE снижает износ компонентов как минимум на 50%, снижает поглощение кислорода, что приводит к окислению, на 30% и снижает содержание нерастворимого пентана (шлама) на 60% при добавлении в заводскую заливку GM®. (Эталонное масло для сертификации DEXRON®).
Уникальное отличие
Смазочные материалы отличаются на молекулярном уровне.Смешивание различных компонентов позволяет преобразовать их молекулярные структуры в характеристики, необходимые для борьбы с окислением, накоплением тепла, вибрацией преобразователя и т. Д. Функция LXE в первую очередь заключается в отводе тепла от фрикционных поверхностей, которые могут видеть поверхностные температуры
в автоматических трансмиссиях более чем 300 градусов по Фаренгейту. LXE поглощает тепло от внутренних металлических поверхностей и передает это тепло на внешнюю металлическую поверхность, где оно рассеивается.
Удаляет тепло
Сложные эфиры LUBEGARD наиболее известны своей способностью «отводить тепло».Радиатор — это поглощение тепла, выделяемого на поверхностях трения, таких как шестерни или зубья шестерен, в масляную фазу. В механических системах тепло поглощается фрикционной поверхностью через объемное масло (синтетическое или минеральное), переносится к стенкам емкости и отводится через них. Например, в автоматической коробке передач тепло переносится и отводится к внешнему металлическому корпусу и системе охлаждения. Когда две металлические поверхности входят в тесный контакт, они сжимают молекулы масла между металлическими поверхностями на границе раздела металл-масло.Трение, возникающее на этом интерфейсе, генерирует тепло (точно так же, как когда вы потираете руки вместе — вы чувствуете тепло от трения на своей коже). Когда в масле присутствует технология LUBEGARD LXE® (Liquid Wax Ester), его молекулы адсорбируются на внутренние металлические поверхности, поглощая тепло и передавая его маслу с металлических поверхностей. Молекулы масла и LXE, содержащие тепло, затем рассеиваются во внешнем металлическом корпусе, где оно рассеивается в атмосферу (окружающую среду).Другие конкурирующие добавки могут фактически удерживать избыточное тепло в критических функциональных областях, что может привести к сбоям.
Superior Lubrication
ГИДРОДИНАМИЧЕСКАЯ СМАЗКА: Системы смазки, в которых движущиеся поверхности фактически разделены масляной пленкой, предотвращающей любой контакт с металлами. Это также называется «полностью пленочной» смазкой. Другими словами; когда металлические поверхности никогда не касаются друг друга. В механическом узле вязкость жидкости влияет на пленку жидкости.Вот почему крайне важно использовать правильную добавку! Движение металлических поверхностей создает трение между поверхностями. Молекулы LXE фактически УДАЛЯЮТ тепло и переносят его к внешнему ядру, тем самым экранируя или защищая внутренние компоненты.
ГРАНИЧНАЯ СМАЗКА: Условия, не допускающие образования смазочной пленки. Другими словами, области, где поверхности действительно соприкасаются. Как при контакте металла с металлом.
Молекулярный состав технологии LXE обеспечивает очень длинную цепочку атомов углерода и содержит углерод-кислородные связи.Атом кислорода сильно притягивается к металлическим поверхностям. Преимущественно, когда молекулы LXE нагреваются во внутренних критических компонентах, высвобождение атомов уносит тепло наружу со спиральной центробежной силой (подобно вращению волчка игрушки в луже с водой) и безвредно переносит его на внешний металлический корпус. Молекулы LUBEGARD LXE на самом деле прикрепляются к металлическим поверхностям — а затем высвобождаются (вместо того, чтобы царапать или надрезать металл) и мгновенно снова восстанавливаются, затем снова высвобождаются, восстанавливаются, снова высвобождаются и продолжают восстанавливаться / высвобождаться бесконечно.
Уникальные результаты
- Только технология LXE была одобрена, одобрена, рекомендована и используется производителями оригинального оборудования.
- Продукты LUBEGARD с технологией LXE имеют восемь сервисных бюллетеней от производителей оригинального оборудования, в которых их дилерским центрам рекомендуется использовать конкретный продукт LUBEGARD для решения конкретной проблемы. Никакой другой конкурирующий продукт не может претендовать на это.
- Продукция LUBEGARD в настоящее время рекомендована и одобрена крупнейшими цепочками ремонта трансмиссий: AAMCO®, Cottman® и LeeMyles®.
- LUBEGARD из года в год удостаивается награды TOP SHOP PRODUCTS и TOP TOOL от профессиональных технических специалистов по трансмиссиям.
- ILI была удостоена престижной награды «Продукт года» за свою запатентованную технологию LXE от компании Lubricants World.
Новаторское исследование ILI привело к получению исследовательских грантов на сумму более 2 миллионов долларов от Министерства сельского хозяйства США, Министерства обороны и Совета по соевым бобам. Сегодня LUBEGARD Automatic Transmission Fluid Protectant является продуктом номер один, используемым в индустрии профессионального восстановления трансмиссий, и единственным продуктом такого рода, который используется и одобрен крупными производителями автомобилей (OEM).
International Lubricants, Inc. получила в общей сложности более 100 патентов в США и за рубежом, и их исследовательские усилия гарантируют, что они остаются в авангарде разработки новых продуктов и улучшений продуктов.
Для ненадежных противоизносных / смазывающих свойств без фосфора, галогена, серы или кислот
Synergol TMS использует тот же уникальный химический состав, что и Synergol FLA, но на окислительно-стабильной основе, что позволяет использовать его во многих формы смазки.Он имеет непосредственный потенциал для замены или уменьшения количества диалкилдитиофосфата цинка (ZDDP), фосфора, хлора или других материалов активного пограничного слоя в смазочных жидкостях. Снижение уровня этих активных ингредиентов делает смазочные материалы более стабильными и менее подверженными коррозии и образованию вредных отложений.
Это направление, в котором движутся все составы смазочных материалов с увеличенным сроком службы.
Synergol TMS представляет собой противоизносный материал с увеличенным сроком службы, поскольку он не расходуется, как жертвенный фосфор и другие реактивные противоизносные присадки, которые присутствуют в современных смазочных системах.
Этот материал имеет огромный потенциал для немедленного применения в будущих системах смазки.
Он служит дольше и работает с обычными противоизносными и противозадирными присадками, не создавая типичной конкуренции для металлических поверхностей, и в то же время снижает риск воздействия на окружающую среду.
Новая парадигма биоразлагаемости с характеристиками
Название ERUCiCHEM® компании International Lubricants, Inc.Разделение сельскохозяйственных (масляных) продуктов произошло от названия свободной кислоты — эруковой кислоты. Эруковая кислота производится гидролизом соответствующего ей триглицеридного эфира, который присутствует в некоторых сельскохозяйственных маслах.
Помимо разработки сельскохозяйственных смазочных материалов для общепромышленного применения, подразделение ERUCiCHEM International Lubricants, Inc. также разработало уникальные смазочные материалы для таких различных отраслей, как косметическая, автомобильная и металлообрабатывающая.
International Lubricants, Inc. Внедрение продуктов сельскохозяйственного происхождения в качестве замены традиционных смазочных материалов на углеводородной основе привело к внедрению трех новаторских запатентованных и запатентованных технологий смазочных материалов — Liquid Wax Esters (LXE®), Synergol® Lubricity и Anti-Wear Технология и полностью натуральный полимерный теломер на биологической основе для косметических применений, который продается под торговой маркой Glossamer® L6600.
ATF-4 (D4B8) Кролик mAb
Хроматин IP
Специально для продукта: SimpleChIP ® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Магнитные шарики) # 9005.
Требуемые реагенты
Реагенты в комплекте:
- Раствор глицина (10X) # 7005
- Буфер A (4X) # 7006
- Буфер B (4X) # 7007
- Чип-буфер (10X) # 7008
- ChIP Elution Buffer (2X) # 7009
- 5 M NaCl # 7010
- 0,5 М ЭДТА # 7011
- Магнитные шарики с протеином G класса ChIP # 9006
- Буфер для связывания ДНК №10007
- Буфер для промывки ДНК (перед использованием добавьте 4-кратный объем этанола) # 10008
- Буфер для элюции ДНК №10009
- Колонки для очистки ДНК и пробирки для сбора # 10010
- Коктейль с ингибиторами протеазы (200X) # 7012
- РНКаза А (10 мг / мл) # 7013
- Нуклеаза микрококка №10011
- Протеиназа К (20 мг / мл) # 10012
- SimpleChIP ® Праймеры экзона 3 RPL30 человека 1 # 7014
- SimpleChIP ® Mouse RPL30 Intron 2 Праймеры 1 # 7015
- Гистон h4 (D2B12) XP ® Кролик mAb (в составе ChIP) # 4620
- Нормальный IgG кролика # 2729
- DTT (дитиотреитол) # 7016
Реагенты, не включенные:
- Стойка для магнитной сепарации # 7017/14654
- Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS-1X) pH7.2 (Стерильно) # 9872
- Вода, не содержащая нуклеаз # 12931
- Этанол (96-100%)
- Формальдегид (37% акций)
- SimpleChIP ® Универсальный мастер-микс qPCR # 88989
! | Это! означает важный шаг в протоколе, касающийся изменения объема в зависимости от количества препаратов иммунопреципитации (IP preps). Один препарат IP определяется как 4 x 10 6 культивированных клеток ткани или 25 мг или дезагрегированной ткани. |
!! | Это !! означает важный шаг по разбавлению буфера перед продолжением. |
БЕЗОПАСНЫЙ ОСТАНОВ | Это безопасная точка остановки в протоколе, если остановка необходима. |
I. Сшивание тканей и подготовка образцов
При заборе ткани удалите из образца нежелательный материал, такой как жир и некротический материал. Затем ткань можно обработать и сразу же сшить или заморозить на сухом льду и хранить при -80 ° C для дальнейшей обработки.Для оптимального выхода хроматина и результатов ChIP используйте 25 мг ткани для каждой иммунопреципитации. Выход хроматина действительно варьируется в зависимости от типа ткани, и для некоторых тканей может потребоваться более 25 мг для каждой иммунопреципитации. См. Приложение A для получения дополнительной информации об ожидаемом выходе хроматина для различных типов тканей. Один дополнительный образец хроматина должен быть обработан для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV). При желании следует обработать пять дополнительных образцов хроматина для оптимизации расщепления хроматина (Приложение B).
Перед запуском:
(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.
- Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль с ингибитором протеазы (PIC) и 10-кратный раствор глицина. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
- Приготовьте 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 15 мкл 200X PIC на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и поместите на лед.
- Приготовьте 45 мкл 37% формальдегида на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и храните при комнатной температуре.Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.
A. Сшивание
- Взвесьте свежий или замороженный образец ткани. Используйте 25 мг ткани для каждого выполняемого IP (для одного эксперимента требуется не менее 75 мг ткани, чтобы включить положительный и отрицательный контроли).
- Поместите образец ткани в чашку диаметром 60 или 100 мм и мелко измельчите чистым скальпелем или бритвенным лезвием. Держите блюдо на льду. Важно держать ткани в холоде, чтобы избежать деградации белков.
- Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку на 15 мл.
- Добавьте 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани в коническую пробирку.
- Чтобы связать белки с ДНК, добавьте 45 мкл 37% формальдегида на 1 мл PBS + PIC и встряхните при комнатной температуре в течение 20 мин. Конечная концентрация формальдегида составляет 1,5%.
- Остановите перекрестное связывание, добавив 100 мкл 10-кратного глицина на 1 мл PBS + PIC, и перемешайте в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Центрифугируйте ткань при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
- Удалите супернатант и промойте один раз 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани.
- Повторите центрифугирование при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
- Удалите супернатант и ресуспендируйте ткань в 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани и храните на льду. Разбейте ткань на суспензию отдельных клеток, используя Medimachine (Часть B) или гомогенизатор Даунса (Часть C). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C перед дезагрегацией до 3 месяцев.
B. Дезагрегация тканей с использованием Medimachine от BD Biosciences (часть № 340587)
- Отрежьте конец наконечника пипетки на 1000 мкл, чтобы увеличить отверстие для переноса кусочков ткани.
- Перенесите 1 мл ткани, ресуспендированной в PBS + PIC, в верхнюю камеру 50 мм medicone (деталь № 340592).
- Растереть ткань в течение 2 минут в соответствии с инструкциями производителя.
- Соберите клеточную суспензию из нижней камеры медикона с помощью шприца на 1 мл и тупой иглы 18 калибра.Перенести клеточную суспензию в коническую пробирку на 15 мл и поместить на лед.
- Повторяйте шаги 2–4, пока вся ткань не превратится в гомогенную суспензию.
- Если необходимо дополнительное измельчение, добавьте в ткань больше PBS + PIC. Повторяйте шаги со 2 по 5, пока вся ткань не будет измельчена до однородной суспензии.
- Проверьте суспензию отдельных клеток под микроскопом (необязательно).
- Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
- Удалить супернатант из клеток и продолжить подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).
C. Дезагрегация тканей с использованием гомогенизатора Dounce
- Перенесите ткань, ресуспендированную в PBS + PIC, в гомогенизатор Даунса.
- Разбейте кусочки ткани 20-25 движениями. Проверьте суспензию отдельных клеток под микроскопом (необязательно).
- Перенесите суспензию клеток в коническую пробирку на 15 мл и центрифугируйте при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
- Удалить супернатант из клеток и продолжить подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).
II. Сшивание культур клеток и подготовка образцов
Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно 4 X 10 6 клеток для каждой иммунопреципитации (требуется не менее 12 X 10 6 клеток для включения положительного и отрицательного контролей). Для клеток HeLa один IP эквивалентен половине 15 см культуральной чашки, содержащей клетки, которые на 90% конфлюэнтны в 20 мл питательной среды. Один дополнительный образец должен быть обработан для анализа переваривания и концентрации хроматина (Раздел IV).Поскольку каждый тип клеток отличается, мы рекомендуем включить в эксперимент одну дополнительную чашку с клетками, которая будет использоваться для определения количества клеток с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
Перед запуском
(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству используемых чашек для культуры ткани диаметром 15 см (или 20 мл суспензионных клеток).
- Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль с ингибитором протеазы (PIC) №7012 и 10-кратный раствор глицина № 7005. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
- Приготовьте 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 10 мкл 200X PIC на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
- Приготовьте 40 мл PBS на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
- Приготовьте 540 мкл 37% формальдегида на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и храните при комнатной температуре. Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.
- Для сшивания белков с ДНК добавьте 540 мкл 37% формальдегида в каждую 15-сантиметровую культуральную чашку, содержащую 20 мл среды.Для суспензионных клеток добавьте 540 мкл 37% формальдегида к клеткам, суспендированным в 20 мл среды (для оптимальной фиксации суспензионных клеток плотность клеток должна быть менее 0,5 x 10 6 клеток / мл при фиксации). Коротко встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация формальдегида составляет 1%. Добавление формальдегида может привести к изменению цвета среды.
- Добавьте 2 мл 10-кратного глицина в каждую 15-сантиметровую чашку, содержащую 20 мл среды, коротко встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.Добавление глицина может привести к изменению цвета среды.
- Для суспензионных клеток перенесите клетки в коническую пробирку на 50 мл, центрифугируйте при 500 x g в настольной центрифуге 5 мин при 4 ° C и дважды промойте осадок 20 мл ледяного PBS. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).
- Для прилипших клеток удалите среду и дважды промойте клетки 20 мл ледяного 1X PBS, каждый раз полностью удаляя смыв из чашки для культивирования.
- Добавьте 2 мл ледяного PBS + PIC в каждую 15-сантиметровую чашку. Соскоблите клетки в холодный буфер. Объедините клетки из всех чашек для культивирования в одну коническую пробирку на 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C до 3 месяцев.
III. Подготовка ядер и расщепление хроматина
Перед запуском
(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл ледяного 1X буфера A + DTT + PIC на IP преп. Инкубируйте на льду 10 мин. Перемешивайте, переворачивая пробирку каждые 3 мин.
- Ядра гранул центрифугированием при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл ледяного 1X буфера B + DTT на IP преп. Повторите центрифугирование, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 мкл 1X буфера B + DTT на IP преп. Перенесите образец в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, всего до 1 мл на пробирку.
- Добавьте 0,5 мкл микрококковой нуклеазы № 10011 на препарат IP, перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C с частым перемешиванием для расщепления ДНК до длины приблизительно 150-900 п.н. Перемешивайте каждые 3-5 мин. Количество микрококковой нуклеазы, необходимое для переваривания ДНК до оптимальной длины, может потребоваться эмпирически для определения отдельных тканей и клеточных линий (см. Приложение B). Ядра HeLa, расщепленные 0,5 мкл микрококковой нуклеазы на 4 × 10 6 клеток, и ткань печени мыши, переваренная 0.5 мкл микрококковой нуклеазы на 25 мг ткани давали фрагменты ДНК соответствующей длины.
- Остановите переваривание, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА # 7011 на препарат IP и поместив пробирку на лед на 1-2 мин.
- Зародыши гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
- Ресуспендируйте ядерный осадок в 100 мкл 1X ChIP Buffer + PIC на каждый IP-препарат и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
- Обработка ультразвуком до 500 мкл лизата на 1,5 мл микроцентрифужную пробирку с несколькими импульсами для разрушения ядерной мембраны.Инкубируйте образцы в течение 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 серий 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100 при настройке 6 с зондом 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
- Осветите лизаты центрифугированием при 9400 x g в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C.
- Перенесите супернатант в новую пробирку. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) Это препарат сшитого хроматина, который следует хранить при -80 ° C до дальнейшего использования. Удалите 50 мкл препарата хроматина для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV). Этот образец объемом 50 мкл можно хранить при -20 ° C в течение ночи.
IV. Анализ расщепления и концентрации хроматина (рекомендуемый этап)
- К 50 мкл образца хроматина (из этапа 9 в разделе III) добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 M NaCl № 7010 и 2 мкл РНКазы A № 7013.Вортекс для смешивания и инкубирования образцов при 37 ° C в течение 30 мин.
- К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте образцы при 65 ° C в течение 2 часов.
- Очистите ДНК из образцов, используя спин-колонки для очистки ДНК, как описано в разделе VII. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) ДНК можно хранить при -20 ° C до 6 месяцев.
- После очистки ДНК удалите образец объемом 10 мкл и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза на 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.ДНК должна быть переварена до длины примерно 150-900 п.н. (от 1 до 5 нуклеосом).
- Чтобы определить концентрацию ДНК, перенесите 2 мкл очищенной ДНК в 98 мкл воды, свободной от нуклеаз, чтобы получить 50-кратное разведение, и прочитайте OD 260 . Концентрация ДНК в мкг / мл составляет OD 260 x 2500. В идеале концентрация ДНК должна составлять от 50 до 200 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ : Для получения оптимальных результатов ChIP очень важно, чтобы хроматин имел соответствующий размер и концентрацию.Избыточное переваривание хроматина может уменьшить сигнал при количественной оценке ПЦР. Недостаточное переваривание хроматина может привести к усилению фонового сигнала и снижению разрешения. Добавление слишком малого количества хроматина к IP может привести к снижению сигнала при количественной оценке ПЦР. Протокол оптимизации переваривания хроматина можно найти в Приложении B.
V. Иммунопреципитация хроматина
Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина (как определено в разделе IV) на иммунопреципитацию.Это должно быть примерно эквивалентно одной 100 мкл IP-препарата из 25 мг дезагрегированной ткани или 4 x 10 6 клеток культуры ткани. Обычно 100 мкл расщепленного хроматина разводят в 400 мкл 1X ChIP Buffer перед добавлением антител. Однако, если на IP требуется более 100 мкл хроматина, препарат сшитого хроматина не нужно разбавлять, как описано ниже. Антитела можно добавлять непосредственно в неразбавленный препарат хроматина для иммунопреципитации хроматиновых комплексов.
Перед запуском
(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитации в эксперименте.
- Удалите и нагрейте коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC) # 7012. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
- Удалите и нагрейте 10X ChIP Buffer # 7008 и убедитесь, что SDS полностью находится в растворе.
- Оттаять расщепленный препарат хроматина (из шага 9 в разделе III) и поместить на лед.
- Приготовьте промывку с низким содержанием соли: 3 мл 1X ChIP Buffer (300 мкл 10X ChIP Buffer # 7008 + 2.7 мл воды) на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.
- Приготовьте промывку с высоким содержанием соли: 1 мл 1X буфера ChIP (100 мкл 10X буфера ChIP # 7008 + 900 мкл воды) + 70 мкл 5M NaCl # 7010 на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.
- В одной пробирке приготовьте достаточно 1X буфера ChIP для разведения расщепленного хроматина до желаемого количества иммунопреципитации: 400 мкл буфера 1X ChIP (40 мкл буфера 10X ChIP + 360 мкл воды) + 2 мкл 200X PIC на иммунопреципитацию .При определении количества иммунопреципитации не забудьте включить образцы положительного контроля гистона h4 (D2B12) XP ® мАт кролика № 4620 и отрицательного контроля нормального кроличьего IgG антитела № 2729. Выложите смесь на лед.
- К приготовленному буферу 1X ChIP добавьте эквивалент 100 мкл (от 5 до 10 мкг хроматина) расщепленного препарата сшитого хроматина (из этапа 9 в разделе III) на иммунопреципитацию. Например, для 10 иммунопреципитации подготовьте пробирку, содержащую 4 мл 1X ChIP Buffer (400 мкл 10X ChIP Buffer + 3.6 мл воды) + 20 мкл 200X PIC + 1 мл препарата расщепленного хроматина.
- Удалите 10 мкл образца разбавленного хроматина и перенесите в пробирку для микроцентрифугирования. Это ваш 2% входной образец, который можно хранить при -20 ° C до дальнейшего использования (шаг 1 в разделе VI).
- Для каждой иммунопреципитации перенесите 500 мкл разбавленного хроматина в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и добавьте иммунопреципитирующие антитела. Количество антител, необходимое для одного IP, варьируется и должно определяться пользователем.Для положительного контроля гистона h4 (D2B12) XP ® Кроличье мАт № 4620 добавьте 10 мкл к образцу IP. Для отрицательного контроля Нормальный кроличий IgG # 2729 добавьте 1 мкл (1 мкг) к 2 мкл (2 мкг) к образцу IP. При использовании антител от Cell Signaling Technology см. Рекомендуемые разведения, указанные в таблице данных или на веб-странице продукта, и рассчитайте количество (мкг) антител IgG для отрицательного контроля на основе концентрации сигнальных антител для сравнения. Инкубируйте образцы IP от 4 часов до ночи при 4 ° C с вращением.
ПРИМЕЧАНИЕ : Большинство антител от Cell Signaling Technology оптимально работают между 1 и 2 мкг на образец IP. В случае, когда имеется несколько образцов с различными концентрациями, лучше всего сопоставить отрицательный контроль нормального кроличьего IgG # 2729 с наивысшей концентрацией антител.
- Ресуспендируйте магнитные шарики с протеином G класса ChIP №9006, осторожно встряхивая. Немедленно добавьте 30 мкл магнитных шариков с протеином G в каждую реакцию IP и инкубируйте в течение 2 ч при 4 ° C с вращением.
- Осадок на магнитных гранулах белка G при каждой иммунопреципитации, помещая пробирки в стойку для магнитного разделения # 7017. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.
- Промойте магнитные шарики с протеином G, добавив к шарикам 1 мл промывочной жидкости с низким содержанием соли, и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении. Повторите шаги 6 и 7 еще два раза, всего 3 промывки с низким содержанием соли.
- Добавьте к шарикам 1 мл промывного раствора с высоким содержанием соли и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении.
- Осадок на магнитных шариках с белком G при каждой иммунопреципитации, помещая пробирки в магнитную разделительную стойку. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант. Сразу переходите к разделу VI.
VI. Элюция хроматина с магнитных шариков антитело / белок G и изменение поперечных сшивок
Перед запуском
(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитации в эксперименте.
- Удалите и нагрейте 2X ChIP Elution Buffer # 7009 на водяной бане с температурой 37 ° C и убедитесь, что SDS находится в растворе.
- Установите водяную баню или термомиксер на 65 ° C.
- Приготовьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP (75 мкл буфера для элюции 2X ChIP № 7009 + 75 мкл воды) для каждой иммунопреципитации и 2% входного образца.
- Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в пробирку с образцом для ввода 2% и отставьте при комнатной температуре до этапа 6.
- Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в каждый образец IP.
- Элюируйте хроматин с магнитных шариков антитела / протеина G в течение 30 мин при 65 ° C с осторожным встряхиванием (1200 об / мин). На этом этапе лучше всего подходит термомиксер. В качестве альтернативы элюирование можно проводить при комнатной температуре с вращением, но оно может быть не таким полным.
- Осадок на магнитные шарики с белком G, поместив пробирки в стойку для магнитного разделения и подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным.
- Осторожно перенесите элюированный супернатант хроматина в новую пробирку.
- Во все пробирки, включая 2% -ный образец, полученный на этапе 1, выполните обратные перекрестные связи, добавив 6 мкл 5M NaCl и 2 мкл протеиназы K # 10012, и инкубируйте 2 часа при 65 ° C.Инкубацию можно продлить на ночь.
- Сразу переходите к Разделу VII. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -20 ° C до 4 дней. Однако, чтобы избежать образования осадка, обязательно нагрейте образцы до комнатной температуры перед добавлением ДНК-связывающего буфера №10007 (раздел VII, этап 1).
VII. Очистка ДНК с использованием спиновых колонок
Перед запуском
- (!!) Добавьте 24 мл этанола (96-100%) в буфер для промывки ДНК №10008 перед использованием.Этот шаг необходимо выполнить только один раз перед первым набором очистки ДНК.
- Удалите по одной пробирке для сбора ДНК для очистки # 10010 для каждого образца ДНК из секции V.
- Добавьте 750 мкл ДНК-связывающего буфера №10007 в каждый образец ДНК и быстро встряхните.
- На каждый 1 объем образца следует использовать 5 объемов буфера для связывания ДНК.
- Перенесите 450 мкл каждого образца из этапа 1 на спин-колонку ДНК в пробирке для сбора.
- Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
- Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
- Перенесите оставшиеся 450 мкл каждого образца из этапа 1 в спин-колонку в пробирке для сбора. Повторите шаги 3 и 4.
- Добавьте 750 мкл буфера для промывки ДНК №10008 в спин-колонку в пробирке для сбора.
- Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
- Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
- Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
- Удалить пробирку для сбора и жидкость. Сохраните спин-колонку.
- Добавьте 50 мкл буфера для элюции ДНК № 10009 в каждую спин-колонку и поместите в чистую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл.
- Центрифуга при 18000 х g в микроцентрифуге в течение 30 секунд для элюирования ДНК.
- Удалите и утилизируйте спин-колонку с ДНК.Элюат теперь представляет собой очищенную ДНК. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) Образцы можно хранить при -20 ° C.
VIII. Количественное определение ДНК с помощью ПЦР
Рекомендации
- Используйте наконечники для пипеток с фильтром, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
- Контрольные праймеры, включенные в набор, специфичны для гена RPL30 человека или мыши (№7014 + №7015) и могут использоваться либо для стандартной ПЦР, либо для количественной ПЦР в реальном времени. Если пользователь выполняет ChIPs от другого вида, рекомендуется, чтобы пользователь разработал соответствующие специфические праймеры для ДНК и определил оптимальные условия ПЦР.
- Рекомендуется использовать Taq-полимеразу Hot-Start для минимизации риска неспецифических продуктов ПЦР.
- Выбор праймера для ПЦР имеет решающее значение. Грунтовки следует разрабатывать с точным соблюдением следующих критериев:
Длина праймера: | 24 нуклеотида |
Оптимальная температура пл .: | 60 ° C |
Оптимальный ГХ: | 50% |
Размер ампликона: | От 150 до 200 п.н. (для стандартной ПЦР) |
от 80 до 160 п.н. (для количественной ПЦР в реальном времени) |
Стандартный метод ПЦР
- Обозначьте соответствующее число 0.2 мл пробирки для ПЦР для количества анализируемых образцов. Они должны включать 2% входной образец, положительный контрольный образец гистона h4, отрицательный контрольный образец нормального кроличьего IgG и пробирку без ДНК для контроля загрязнения ДНК.
- Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку.
- Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже, убедившись, что добавлено достаточно реагента для двух дополнительных пробирок, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл мастер-микса в каждую реакционную пробирку.
Реагент | Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл) |
---|---|
Без нуклеаз H 2 O | 12,5 мкл |
Буфер для ПЦР 10X | 2,0 мкл |
4 мМ dNTP Mix | 1,0 мкл |
5 мкМ RPL30 Праймеры | 2,0 мкл |
ДНК-полимераза Taq | 0,5 мкл |
- Запустить следующую программу реакции ПЦР:
а. | Начальная денатурация | 95 ° C | 5 мин |
б. | Денатурация | 95 ° C | 30 сек |
г. | Отжиг | 62 ° C | 30 сек |
г. | Удлинитель | 72 ° C | 30 сек |
e. | Повторите шаги b-d всего 34 цикла. | ||
ф. | Окончательное удлинение | 72 ° C | 5 мин |
- Удалите 10 мкл каждого продукта ПЦР для анализа электрофорезом в 2% агарозном геле или 10% полиакриламидном геле с маркером ДНК 100 п.н.Ожидаемый размер продукта ПЦР составляет 161 п.н. для RPL30 # 7014 человека и 159 п.н. для RPL30 # 7015 мыши.
Метод количественной ПЦР в реальном времени
- Пометьте соответствующее количество пробирок для ПЦР или планшетов для ПЦР, совместимых с моделью используемого ПЦР-аппарата. Реакции ПЦР должны включать образец гистона h4 положительного контроля, образец нормального кроличьего IgG отрицательного контроля, пробирку без ДНК для контроля контаминации и серийное разведение 2% входящей ДНК хроматина (неразбавленной, 1: 5, 1:25). , 1: 125), чтобы построить стандартную кривую и определить эффективность усиления.
- Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку или лунку планшета для ПЦР.
- Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже. Добавьте достаточно реагентов для двух дополнительных реакций, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл реакционной смеси в каждую реакционную пробирку или лунку для ПЦР. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) При необходимости накройте пластину алюминиевой фольгой во избежание попадания света и храните при 4 ° C до 4 часов или -20 ° C в течение ночи, пока машина не будет готова к использованию.
Реагент | Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл) |
---|---|
Без нуклеаз H 2 O | 6 мкл |
5 мкМ RPL30 Праймеры | 2 мкл |
SimpleChIP ® Универсальный мастер-микс для кПЦР # 88989 | 10 мкл |
- Запустить следующую программу реакции ПЦР:
а. | Начальная денатурация | 95 ° C 3 мин |
б. | денатурация | 95 ° C 15 сек |
г. | Отжиг и удлинение: | 60 ° C 60 сек |
г. | Повторите шаги b и c всего 40 циклов. |
Проанализируйте количественные результаты ПЦР с помощью программного обеспечения, поставляемого с аппаратом ПЦР в реальном времени. В качестве альтернативы можно рассчитать эффективность IP вручную, используя метод процентного ввода и уравнение, показанное ниже.С помощью этого метода сигналы, полученные от каждой иммунопреципитации, выражаются в процентах от общего входящего хроматина.
Входной процент в процентах = 2% x 2 (C [T] 2% входной выборки — C [T] IP выборки)
C [T] = C T = Пороговый цикл реакции ПЦР
IX. Создание библиотеки NG-секвенирования
Иммунообогащенные образцы ДНК, полученные с помощью этого набора, напрямую совместимы с ChIP-seq. Для создания библиотеки ДНК для последующего секвенирования NG используйте протокол или набор для подготовки библиотеки ДНК, совместимый с вашей платформой для последующего секвенирования.Для секвенирования на платформах Illumina ® мы рекомендуем SimpleChIP ® ChIP-seq DNA Library Prep Kit для Illumina ® # 56795 и связанных с ним индексных праймеров SimpleChIP ® ChIP-seq Multiplex Oligos для Illumina ® (одиночный Индексные праймеры) # 29580 или SimpleChIP ® ChIP-seq Multiplex Oligos для Illumina ® (двойные индексные праймеры) # 47538.
Рекомендации:
- Для фактора транскрипции или кофактора ChIP-seq используйте не менее 5 нг ДНК, обогащенной ChIP, и амплификацию ДНК с лигированием адаптера с помощью 10 циклов ПЦР.
- Для полных модификаций гистонов и гистонов или вводимых образцов начните с 50 нг ChIP-обогащенной ДНК и амплификации ДНК с лигированием адаптера с 6 циклами ПЦР.
- Для создания библиотеки ChIP-обогащенной ДНК для всех типов мишеней выполните очистку ДНК с лигированной адаптерами без выбора размера.
- После создания библиотеки ДНК проверьте библиотеку ДНК на наличие димеров адаптера (~ 140 п.н.) с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Cat # G2938-) или с помощью электрофореза в агарозном геле с 50-100 нг ДНК на 2% агарозный гель TAE.Если димеры адаптера присутствуют в библиотеке ДНК, повторите очистку амплифицированного ПЦР материала.
- Качество библиотеки также можно подтвердить с помощью количественной ПЦР и наборов праймеров для известных положительных и отрицательных целевых локусов. Положительные пары праймеров должны по-прежнему давать такой же высокий сигнал по сравнению с отрицательными праймерами, как это видно в исходном анализе qPCR ДНК, обогащенной ChIP.
- После окончательной очистки и проверки качества подготовьте окончательные очищенные образцы библиотеки при 2–10 нМ для высокопроизводительного секвенирования.
ПРИЛОЖЕНИЕ A: Ожидаемый выход хроматина
При сборе сшитого хроматина из образцов ткани выход хроматина может значительно варьироваться между типами тканей. В таблице справа представлен диапазон ожидаемого выхода хроматина из 25 мг ткани по сравнению с 4 x 10 6 клеток HeLa и ожидаемой концентрации ДНК, как определено в разделе IV протокола. Для каждого типа ткани дезагрегация с использованием Medimachine (BD Biosciences) или гомогенизатора Даунса давала аналогичные количества хроматина.Однако хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием Medimachine, обычно давал более высокую IP-эффективность, чем хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием гомогенизатора Даунса. Гомогенизатор Даунса настоятельно рекомендуется для дезагрегации мозговой ткани, поскольку Medimachine не может адекватно дезагрегировать мозговую ткань в одноклеточную суспензию. Для оптимальных результатов ChIP мы рекомендуем использовать от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина на иммунопреципитацию; поэтому для некоторых тканей может потребоваться сбор более 25 мг на каждую иммунопреципитацию.
Ткань / клетка | Общий выход хроматина | Ожидаемая концентрация ДНК |
---|---|---|
Селезенка | 20-30 мкг на 25 мг ткани | 200-300 мкг / мл |
Печень | 10-15 мкг на 25 мг ткани | 100-150 мкг / мл |
Почки | 8-10 мкг на 25 мг ткани | 80-100 мкг / мл |
Мозг | 2-5 мкг на 25 мг ткани | 20-50 мкг / мл |
Сердце | 2-5 мкг на 25 мг ткани | 20-50 мкг / мл |
HeLa | 10-15 мкг на 4 x 10 6 клеток | 100-150 мкг / мл |
ПРИЛОЖЕНИЕ B: Оптимизация расщепления хроматина
Оптимальные условия для переваривания сшитой ДНК хроматина до 150-900 пар оснований в значительной степени зависят от отношения микрококковой нуклеазы к количеству ткани или количеству клеток, используемых для переваривания.Ниже приведен протокол определения оптимальных условий пищеварения для конкретной ткани или типа клеток.
- Подготовьте сшитые ядра из 125 мг ткани или 2 X 10 7 клеток (эквивалент 5 IP-препаратов), как описано в разделах I, II и III. Остановитесь после шага 2 раздела III и действуйте, как описано ниже.
- Перенесите 100 мкл препарата ядер в 5 отдельных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и поместите на лед.
- Добавьте 3 мкл исходного раствора микрококковой нуклеазы к 27 мкл 1X буфера B + DTT (разведение фермента 1:10).
- В каждую из 5 пробирок на этапе 2 добавьте 0 мкл, 2,5 мкл, 5 мкл, 7,5 мкл или 10 мкл разведенной нуклеазы микрококка, перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C с частым смешивание.
- Остановите каждый гидролизат, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА и поместив пробирки на лед.
- Зародыши гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
- Ресуспендировать ядерный осадок в 200 мкл 1X ChIP Buffer + PIC.Инкубируйте на льду 10 мин.
- Обработка лизата ультразвуком с помощью нескольких импульсов для разрушения ядерной мембраны. Инкубируйте образцы 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 наборов 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100, установленного на настройку 6 с помощью зонда 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
- Осветите лизаты центрифугированием при 9400 x g в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C.
- Перенесите по 50 мкл каждого лизата, обработанного ультразвуком, в новые микроцентрифужные пробирки.
- К каждому 50 мкл образца добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 М NaCl и 2 мкл РНКазы А. Вихревым движением перемешайте и инкубируйте образцы при 37 ° C в течение 30 мин.
- К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте образец при 65 ° C в течение 2 часов.
- Удалите 20 мкл каждого образца и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.
- Обратите внимание на то, при каких условиях переваривания получается ДНК в желаемом диапазоне от 150 до 900 пар оснований (от 1 до 5 нуклеосом). Объем разбавленной микрококковой нуклеазы, который дает желаемый размер фрагментов ДНК с использованием этого протокола оптимизации, эквивалентен 10-кратному объему исходного раствора микрококковой нуклеазы, который должен быть добавлен к одному препарату для иммунопреципитации (25 мг дезагрегированных тканевых клеток или 4 X 10 6 клеток культуры ткани) для получения фрагментов ДНК желаемого размера.Например, если 5 мкл разбавленной микрококковой нуклеазы продуцируют фрагменты ДНК из 150-900 пар оснований в этом протоколе, то 0,5 мкл исходной микрококковой нуклеазы следует добавить к одному препарату IP во время переваривания хроматина в разделе III.
- Если результаты показывают, что размер ДНК не соответствует желаемому диапазону, повторите протокол оптимизации, соответствующим образом регулируя количество микрококковой нуклеазы в каждом гидролизате. В качестве альтернативы время переваривания можно изменить, чтобы увеличить или уменьшить степень фрагментации ДНК.
ПРИЛОЖЕНИЕ C: Руководство по поиску и устранению неисправностей
Проблема | Возможные причины | Рекомендация |
---|---|---|
1. Слишком низкая концентрация расщепленного хроматина. | Для переваривания хроматина добавлено недостаточно клеток или ядра не были полностью лизированы после переваривания. | Если концентрация ДНК в препарате хроматина близка к 50 мкг / мл, добавьте дополнительный хроматин к каждому IP, чтобы получить не менее 5 мкг / IP, и продолжайте выполнение протокола. Подсчитайте отдельные чашки клеток перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток и / или визуализировать ядра под микроскопом до и после обработки ультразвуком, чтобы подтвердить полный лизис ядер. |
2. Хроматин недостаточно переварен, а фрагменты слишком большие (более 900 п.н.). | Клетки могли быть чрезмерно сшиты. Поперечное сшивание более 10 мин может ингибировать переваривание хроматина. Для расщепления хроматина было добавлено слишком много клеток или недостаточно микрококковой нуклеазы. | Выполните временной курс при фиксированной концентрации формальдегида. Сократите время сшивания до 10 минут или меньше. Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина. |
3. Хроматин переваривается, и фрагменты слишком малы (длина мононуклеосомы исключительно 150 п.н.). Полное расщепление хроматина до мононуклеосомной ДНК может уменьшить сигнал во время количественной оценки ПЦР, особенно для ампликонов длиной более 150 п.н. | Для переваривания хроматина добавлено недостаточно клеток или слишком много микрококковой нуклеазы. | Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина. |
4. Нет продукта или очень мало продукта во входных реакциях ПЦР. | В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК или условия не оптимальны. Область амплификации ПЦР может охватывать область, свободную от нуклеосом. К IP добавлено недостаточно хроматина или хроматин переваривается. | Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации. Оптимизируйте условия ПЦР для экспериментального набора праймеров, используя очищенную ДНК из сшитого и расщепленного хроматина. Разработайте другой набор праймеров и уменьшите длину ампликона до менее 150 п.н. (см. Рекомендации по созданию праймеров в разделе VIII). Для оптимальных результатов ChIP добавьте 5-10 мкг хроматина на IP.См. Рекомендации по проблемам 1 и 3 выше. |
5. В положительном контроле нет продукта. ПЦР-реакция гистона h4-IP RPL30. | В реакцию IP добавлено недостаточно хроматина или антител или время инкубации IP слишком короткое. Неполное элюирование хроматина с гранул белка G. | Обязательно добавьте 5-10 мкг хроматина и 10 мкл антитела в каждую реакцию IP и инкубируйте с антителом в течение ночи и еще 2 часа после добавления шариков с протеином G. Элюция хроматина из шариков с протеином G оптимальна при 65 ° C с частым перемешиванием, чтобы шарики оставались суспендированными в растворе. |
6. Количество продукта в отрицательном контроле IgG-IP кролика и положительном контроле ПЦР-реакции на гистон h4-IP эквивалентно. | В реакцию IP добавлено слишком много или недостаточно хроматина. В качестве альтернативы, в реакцию IP добавлено слишком много антител. Слишком много ДНК добавлено в реакцию ПЦР или слишком много циклов амплификации. | Добавьте не более 15 мкг хроматина и 10 мкл антитела к гистону h4 в каждую реакцию IP. Уменьшите количество нормального кроличьего IgG до 1 мкл на IP. Добавьте меньше ДНК в реакцию ПЦР или уменьшите количество циклов ПЦР. Очень важно, чтобы продукты ПЦР анализировались в рамках фазы линейной амплификации ПЦР. В противном случае невозможно точно измерить разницу в количествах исходной ДНК. |
7. Нет продукта в реакции ПЦР экспериментального антитела-IP. | В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК. В реакцию IP добавлено недостаточно антител. Антитело не работает для IP. | Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации. Обычно к IP-реакции добавляют от 1 до 5 мкг антитела; однако точное количество сильно зависит от индивидуального антитела. Увеличьте количество антител, добавленных к IP. Найдите альтернативный источник антител. |
, опубликовано в декабре 2011 г.
после внесения изменений в июнь 2018 г.
Использование системы ATF для культивирования клеток яичника китайского хомячка в концентрированной периодической системе с подпиткой культивирование со свежей питательной средой в процессе, известном как перфузия. Обычно этот процесс выполняется с использованием фильтра или другого устройства для удержания клеток, где белковый продукт собирается вместе с потоком отходов, в то время как клетки остаются в реакторе.Непрерывное удаление продукта через поток отходов предотвращает его накопление в емкости. Быстрое удаление и хранение дает важное преимущество для некоторых лабильных продуктов, но, как правило, собираемый большой объем нежелателен. Система ATF, используемая в процессе концентрированной партии с подпиткой (CFB), использует преимущества высоких концентраций клеток и, как следствие, высоких уровней образования продукта, обеспечиваемых перфузией, и в то же время исключает разбавление продукта. Процесс ATF System CFB реализуется просто с использованием стандартного фильтра с отсечкой по молекулярной массе, обычно 50 кДа.Фильтр позволяет отходам или любому соединению, размер пор которого меньше указанного, но не более крупным молекулам. Антитела и многие другие потенциальные белки или продукты размером более 50 кДа задерживаются фильтром. Таким образом, клетки и продукт могут быть сконцентрированы до высоких удельных концентраций. Biovian провела сравнение стандартной партии с подпиткой и CFB, чтобы оценить различия между этими двумя процессами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМатериалы
Система ATF : Refine Technology Система переменного тангенциального потока (ATF2) с использованием модуля F2 с полым волокном, поры 50 кДа, PS, внутренний диаметр 1 мм, 0.14 м 2
Волновой реактор : Wave Cellbase 20 PS с блоком управления Wave Biotech BWC
Волновой мешок : Sartorius-Stedim Cultibag RM 2 L Optical ATF и стерильный коннектор Opta SFT
Среда : HyClone SFM4CHO
Клетки СНО: Клеточная линия СНО, экспрессирующая человеческий иммуноглобулин G (hIgG)
Анализ продукта : иммуноанализ hIgG.
Методы
Посевную культуру клеток СНО готовили во вращающейся колбе.Клетки переносили в волновой реактор при начальной концентрации приблизительно 0,4 × 10 6 клеток / мл (день 1). Объем культурального мешка составлял приблизительно 1 л. Мешок был оборудован оптическими датчиками для измерения растворенного кислорода (DO) и pH в оперативном режиме. Аэрацию не начинали до 2-го дня для поддержания pH. После этого поддерживали аэрацию на уровне 100 мл / мин. Концентрация кислорода поддерживалась в соответствии с инструкциями производителя путем увеличения параметров породы и угла.
В контрольном опыте с подпиткой питательные вещества, такие как питание CD и глюкоза, подавались партиями в четыре разных момента времени в течение процесса. Уровень pH регулировался автоматически.
В экспериментах ATF CFB система ATF была подключена к культуральному мешку. Поток начинали на 2-й день при постоянной скорости потока 0,5 л / мин. Перфузия (поступление свежей среды и выход отработанной среды) началась на 3-й день. В ходе 1 скорость перфузии была начата с 0,8 л / день и увеличилась до 1.2 л / сут. В опыте 2 он был начат с 0,8 л / день и увеличился до 2,5 л / день к 7-му дню. Скорости добавления среды и оттока отходов определялись по изменению веса соответствующих контейнеров.
Образцы объемом примерно 2 мл удаляли из мешка для культивирования с помощью шприца не реже одного раза в день. DO и pH регистрировались во время отбора проб. Аликвоту образца немедленно замораживали при –20 ° C для анализа продукта, выполняемого после окончания фактического эксперимента. После отбора проб определяли концентрацию глюкозы и лактата.Концентрацию клеток и жизнеспособность клеток анализировали путем разбавления образца фосфатно-солевым буфером и трифановым синим перед автоматическим подсчетом живых и мертвых клеток счетчиком клеток. Продукт анализировали иммуноанализом на hIgG.
РЕЗУЛЬТАТЫС подпиткой
Результаты периодического культивирования с подпиткой, показанные на рисунках 1–6, типичны для таких культур. Наблюдалась быстрая потеря жизнеспособности после фазы роста (см. Рисунки 1, 2), продолжающееся увеличение концентрации продукта после того, как культура начала снижаться (см. Рисунок 3) и накопление продуктов жизнедеятельности (лактата, см. Рисунок 4), что сопровождалось неуклонное снижение концентрации глюкозы и DO (см. рисунки 5, 6).Добавление к подпитанной периодической культуре четыре раза питательной средой в ходе культивирования привело к пиковой концентрации клеток 5,8 × 10 6 клеток / мл через 191 час (см. Рисунок 1). Как и ожидалось, максимальная концентрация продукта была несколько отложена, достигнув 0,4 г / л, через 260 часов (см. Рисунок 3).
Рис. 1: Количество жизнеспособных клеток в сериях с подпиткой и концентрированных сериях с подпиткой. (ВСЕ ЦИФРЫ ПРЕДОСТАВЛЕНЫ АВТОРАМИ)
Первый запуск CFB
Преимущества добавления свежей среды при удалении отработанной среды также показаны на рисунках 1–6.pH был установлен в процессе без необходимости отдельного контроля pH (см. рисунок 7). Скорость перфузии в этом опыте варьировалась от 0,8 до 1,5 об / день (см. Рисунок 8). Первый пробег был далеко не идеальным. При измерении веса мешка Wave и связанного с ним контура управления для поддержания постоянного уровня в мешке возникла проблема, приводящая к слишком большому рабочему объему. Ручная регулировка была произведена путем быстрого увеличения потока фильтрата для удаления этой избыточной среды. Однако эта регулировка была слишком быстрой для очистки системы ATF, и выполненная по существу тупиковая фильтрация привела к отказу фильтра.Жизнеспособность начала снижаться в начале эксперимента, менее чем через 150 часов, и примерно в то же время количество жизнеспособных клеток также стабилизировалось (см. Рисунки 1,2). Перфузия была завершена через 239 часов, и, несмотря на трудности, пиковая концентрация клеток 16,4 × 10 6 клеток / мл была достигнута через 195 часов (см. Рисунок 1), тогда как самая высокая концентрация продукта, 1,9 г / л, была достигнута. было достигнуто через 239 ч (см. рисунок 3).
Рис. 2: Процент жизнеспособных клеток в циклах с подпиткой и концентрированных партиях с подпиткой.
Второй цикл CFB
Второй цикл CFB с системой ATF несколько отличался от первого цикла CFB.Это было выполнено с более быстрым увеличением скорости перфузии примерно вдвое по сравнению с окончательной скоростью первого цикла. Скорость перфузии в этом опыте варьировалась от 0,8 до 2,5 об / день (см. Рисунок 8). Рост клеток поддерживался дольше, чем в первом прогоне, достигая значительно более высокой концентрации клеток. Наивысшая концентрация клеток, 34,5х10 6 клеток / мл, была достигнута через 284 часа (см. Рисунок 1), тогда как самая высокая концентрация продукта, 3,8 г / л, была достигнута через 332 часа (см. Рисунок 3). Жизнеспособность культуры поддерживалась выше 85% на протяжении всего культивирования (см. Рисунок 2).После первоначальной корректировки уровни глюкозы и лактата поддерживались примерно на постоянном уровне в течение большей части продолжительности культивирования (см. Рисунки 4, 5).
Рис. 3: Концентрация продукта в циклах с подпиткой и концентрированных партиях с подпиткой.
ОБСУЖДЕНИЕРезультаты в таблице I показывают, что концентрацию ячеек и, что более важно, концентрацию продукта можно значительно повысить с помощью процесса CFB системы ATF. Даже в первом прогоне CFB, который был неоптимальной культурой, была достигнута почти в три раза более высокая концентрация клеток и было получено более чем 4-кратное увеличение концентрации продукта, чем в партии с подпиткой, примерно за тот же период времени.Результаты улучшились еще больше во втором прогоне CFB, увеличив концентрацию продукта почти в десять раз. Скорость подачи среды, по-видимому, сильно повлияла на скорость роста клеток и уровни продукта. Дальнейшее улучшение возможно за счет обогащения кислородного переноса и развития среды.
Рис. 4. Концентрация лактата в циклах с подпиткой и концентрированных партиях с подпиткой.
Несмотря на увеличение концентрации продукта в ЦФБ по сравнению с загружаемой партией, необходимо оценить и понять конечную производительность и экономические аспекты обоих режимов процесса.Некоторые соображения включают объемную емкость реактора и необходимое количество продукта, а также время, необходимое для производства этого количества продукта.
Рис. 5: Концентрация глюкозы в циклах с подпиткой и концентрированной партии с подпиткой.
Используя данные, полученные в этих экспериментах, партия с подпиткой сравнивается с CFB. Предлагаются три производственных сценария (случай A, B и C в таблице II) для производства 3,8 г hIgG, что было достигнуто во втором прогоне ATF, и 100 г hIgG.
Рис. 6. Растворенный кислород (DO) в циклах с подпиткой и концентрированных партиях с подпиткой.
Таблицу II можно использовать для оценки требований к производству определенного количества продукции и дальнейшего анализа того, соответствуют ли эти требования потребностям или возможностям пользователя. Например, если у пользователя есть реакторы объемом 1 л, но он желает произвести 4 г продукта, то для этого потребуется более 3 месяцев и 9 партий, используя режим с подпиткой (случай B), но потребуется только 1 партия и две недели в режиме концентрированной партии с подпиткой (Случай C). Учитывая риски запуска 9 партий вместо 1 и дополнительные накладные расходы в течение 3 месяцев, переход на концентрированную партию с подпиткой дает значительное преимущество при затратах всего 2.В 5 раз больше по СМИ.
Рис. 7: pH в циклах с подпиткой и концентрированной партии с подпиткой.
Приведенная выше взаимосвязь, очевидно, актуальна для реактора любого размера: если у пользователя есть 100-литровый реактор, возможно, одноразовый биореактор, и ему нужно 400 г продукта, ему потребуется около 10 партий и четыре месяца с периодическим процессом с подпиткой. (Случай B). Пользователь может подумать о покупке нового реактора на 1000 л, который будет выполнять работу одной партией, но также потребует сопутствующих аксессуаров, оборудования, расположенного ниже по технологической цепочке, и производственных площадей.В качестве альтернативы пользователь может использовать систему ATF, которая доставит 400 г, требуемых за одну партию, в существующем 100-литровом (Вариант C).
Рис. 8: Расход при концентрированных циклах с подпиткой.
Если у пользователя есть три реактора, 25 л, 100 л и 250 л на выбор, и требуется 100 г продукта, то вариант с подпиткой на 250 л, кажется, будет немного лучше. чем партия 100 л с подпиткой с более длительным производственным циклом или система CFB на 25 л с аналогичными сроками производства, но с более дорогостоящим использованием среды.Однако при рассмотрении расширения затравки для этого 250-литрового реактора, которое не учитывается в примерах в Таблице II, оказывается, что реакторы на 25 и 100 л все равно необходимы; Таким образом, при оценке риска по сравнению с выгодой от использования системы на 25, 100 или 250 л они кажутся одинаковыми в каждом случае. Также необходимо учитывать другие факторы, такие как последующая переработка 25-литрового урожая по сравнению с 250-литровым.
Таблица I: Сводка результатов.
В еще одном сценарии: что, если у пользователя есть несколько реакторов на 25 л и только один реактор на 250 л, но он желает производить несколько продуктов за ограниченное время? Очевидно, что концентрированный подход с подпиткой наиболее легко может достичь этой цели.Несколько реакторов емкостью 25 л можно использовать одновременно, не дожидаясь освобождения основного реактора. Реакторы на 25 литров также не будут использоваться в качестве затравок для 250-литрового реактора.
Таблица II: Продукция человеческого иммуноглобулина G (hIgG) с использованием периодического действия с подпиткой и концентрированного периодического действия с подпиткой.
ЗАКЛЮЧЕНИЕИспользование системы ATF для достижения исключительно высокой производительности при использовании в концентрированном периодическом процессе с подпиткой обеспечивает более эффективный переход к работе в восходящем направлении.Кроме того, в случае установки среднего или меньшего размера устраняется необходимость увеличения мощности за счет масштабирования реактора. Система ATF позволяет более гибко адаптировать имеющееся оборудование к растущим производственным требованиям.
Поскольку систему ATF можно также использовать для производства банков ячеек большой плотности и большого объема в одноразовых мешках, которые используются для инокуляции небольших или даже экспериментальных реакторов непосредственно из морозильной камеры, установка может быть дополнительно оптимизирована. Аналогичным образом, для расширения затравки система ATF может уменьшить длину цепочки реакторов, освобождая существующие реакторы для других производственных требований.
Для предприятия, использующего или планирующего использовать одноразовые реакторы, возможность переназначения мощности для новых проектов может быть очень ценной для снижения затрат и рисков в биопроизводстве.
Джон Бонэм-Картер * — вице-президент, Джерри Шевиц — президент и Эди Элиэзер — вице-президент, все в Refine Technology LLC, Пайн-Брук, Нью-Джерси, [email protected]. Ян Вигар и Антти Ниеминен — оба старшие ученые в Биовиане, Турку, Финляндия.
ЖИДКОСТЬ ДЛЯ АВТОТРАНСМИССИИ | ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ
Жидкости для автоматических трансмиссий, разработанные, чтобы превосходить спецификации
Автоматические трансмиссии сейчас сложнее, чем когда-либо, что предъявляет все более высокие требования к жидкостям для автоматических трансмиссий. Фактически, автоматическая коробка передач, пожалуй, самый сложный механический компонент в автомобиле. Автоматическая трансмиссия сочетает в себе электрические и механические системы, гидравлику и компьютерные процессоры для плавного переключения передач
и передачи мощности двигателя на ведущие колеса.
Какие бывают АКПП?
Во всем мире существует 3 основных типа автоматических коробок передач. Коробка передач с двойным сцеплением (или DCT), бесступенчатая трансмиссия (или CVT) и ступенчатая трансмиссия являются наиболее распространенными, особенно здесь, в США. Есть несколько основных компонентов, из которых состоит ступенчатая трансмиссия. Насос подает трансмиссионную жидкость под давлением для многих целей в установке.Планетарные передачи обеспечивают выбранные передаточные числа для автомобиля. Муфты или «пакеты сцеплений» включают и выключают зубчатые передачи. Гидротрансформатор соединяет трансмиссию с двигателем и увеличивает крутящий момент во время начального ускорения. В нем используются две турбины, которые вращаются независимо, но которые связаны между собой по жидкости, что позволяет двигателю работать на холостом ходу, когда двигатель остановлен, и обеспечивать более плавное ускорение при переключении передач. Наконец, мехатроника — это «мозг» трансмиссии, сложная система портов, клапанов и электроники, которая контролирует все функции трансмиссии.
Одним из компонентов всей системы, который имеет решающее значение для правильной совместной работы всех этих частей, является жидкость для автоматической коробки передач или ATF. Он действует как гидравлическая жидкость для включения пакетов сцепления и переключения передач. Он действует как ингибитор коррозии и защищает планетарные редукторы от износа. Он должен легко течь от минус 40 градусов по Фаренгейту до почти 400, даже в узлах с тонкими клапанами. ATF точно контролирует трение в муфтах сцепления и поддерживает его в течение всего интервала замены … что, возможно, является самым важным свойством ATF, обеспечивая смазку сотен движущихся частей даже при высоких температурах и экстремальном давлении.Поэтому использование правильного ATF имеет решающее значение для производительности и длительного срока службы вашей коробки передач.
Портфель Castrol® Transmax включает широкий спектр жидкостей для автоматических трансмиссий, разработанных для защиты критически важных компонентов трансмиссии, включая продукты, лицензированные GM, Ford и Chrysler, а также жидкости, соответствующие требованиям JASO для популярных японских импортных товаров из Toyota. Хонда и Ниссан.
Smooth Drive Technology ™: в состав некоторых продуктов Castrol Transmax входит Smooth Drive Technology ™ , которые представляют собой активные управляющие молекулы, которые автоматически регулируют свой уровень трения при изменении давления и скорости, обеспечивая более плавное движение в течение длительного времени.