Гликогена функции: Всё, что вы хотели знать про гликоген

Чтобы получить представление о метаболизме Chlamydiae, мы проанализировали 220 гликогенов. разные виды хламидий.Как показано на рис. 1a, синтез линейных цепей синтеза как линейной активности АДФ-глюкозопирофосфорилазы (GlgC), так и активности гликогенсинтазы (GlgA) в пути GlgC, в то время как путь GlgE зависит от трегалозосинтазы (TreS), мальтокиназы (Mak ) и мальтозил-1-фосфаттрансфераза (GlgE). Образование α-1,6-связей (то есть точек ветвления) и деградация гликогена катализируются набором аналогичных ферментов в обоих путях, которые включают изоформы ферментов ветвления гликогена (GlgB / GlgB2) и изоформы фосфорилаз гликогена (GlgP / GlgP2), ферменты разветвления гликогена (GlgX) и изоформы гликогенфосфорилазы Геномная база данных, использованная в этом исследовании (https: // chlamdb.ch) включает геномы как культивируемых, так и некультивируемых видов Chlamydiae, которые охватывают все разнообразие филума хламидий (рис. 1b). Следует подчеркнуть, что несколько семейств и родовых линий охватывают исключительно некультивируемые виды Chlamydiae. Как следствие, геномы, производные от метагеномных данных, были тщательно повторно аннотированы и подвергались различным критериям качества, таким как доля основных генов, как сообщалось ранее ³ . Сравнительная геномика четко подчеркнула высокую распространенность полного пути GlgC у большинства Chlamydiales , включая всех членов семейства Chlamydiaceae , которые подверглись массивной редукции генома (обозначенной буквой «d» на рис.1b), а также в наиболее разветвленных семействах, таких как Candida Pelagichlamycidiaceae («a») и Candidatus Parilichlamydiaceae («b»). Мы заметили, что гены glg разнесены по крайней мере на 10 т.п.н., за заметным исключением для glgP и glgC , которые в большинстве случаев разделены одним или двумя генами. Следует проявлять осторожность при интерпретации пробелов в путях метаболизма гликогена у нескольких некультивируемых хламидий, что, вероятно, отражает тот факт, что многие из этих геномов являются неполными геномами, полученными в результате метагеномных исследований (см. Процентные значения в скобках на рис.1б). Учитывая, что путь GlgC высоко консервативен почти во всех секвенированных геномах типа, отсутствующие гены, вероятно, отражают недостающие данные, а не потерю генов. Интересно отметить, что существует некоторая неопределенность в отношении присутствия гена glgC в геноме Candida Enkichlamydia («j»), поскольку был восстановлен полный набор ферментов, метаболизирующих гликоген, за исключением гена, кодирующего ADP- глюкозопирофосфорилаза (glgC). Этот ген отсутствует в шести независимых черновиках геномов, которые, по оценкам, завершены на 71–97%, что предполагает либо потерю гена glgC , либо то, что ген glgC расположен в определенной области генома (например,g., рядом с повторяющимися последовательностями), что систематически приводило к его отсутствию в сборках генома. Другой неожиданный результат касается семейств Waddliaceae («l») и Criblamydiaceae («m»), которые включают Waddlia chondrophila , Estrella lausannensis и Criblamydia sequanensis . Геномные перестройки вызвали последовательность событий, ведущих к (i) делеции генов glgC и glgP , (ii) слиянию glgA с геном glgB , (iii) вставке гена glgP2 Ген , кодирующий изоформу гликогенфосфорилазы в непосредственной близости от гена malQ .Следует отметить, что гомолог glgP2 также был идентифицирован в плазмидах S. nevegensis и P. naegleriophila . В W. chondrophila , другая вставка glgP2 произошла ниже оперона GlgE, что может быть коррелировано с частичной делецией glgP2 вблизи malQ (рис. 1b). Экономная интерпретация делеций glgC и glgP и слияния glgAglgB заключается в том, что событие одиночной делеции привело к потере фрагмента ДНК, несущего гены glgP и glgC между glgA и glgB .Однако, несмотря на множество вариаций, геномная конфигурация, совместимая с этой скупой гипотезой, никогда не наблюдалась у существующих Chlamydiae (дополнительная таблица 1). Скорее, такие геномные перестройки связаны с новым путем гликогена, основанным на опероне GlgE, описанном у микобактерий, а также наблюдаемом у Prototochlamydia naegleriophila и Protochlamydia phocaeensis (син. Parachlamydia C2). Все три гена сгруппированы в классической неслитой структуре оперонов glgE-treSmak-glgB2 в Waddliaceae и Criblamydiaceae , тогда как ген glgB2 отсутствует в оперонах Parachlamydiaceae (рис.1б). Наличие пути GlgE, ограниченного семействами Parachlamydiaceae , Waddliaceae и Criblamydiaceae , вызывает вопрос о его происхождении от Chlamydiales. Чтобы получить некоторое представление об этом вопросе, филогенетические деревья TreS-Mak и GlgE были выведены с использованием метода филобайеса (рис. 2). Филогения GlgE показывает, что даже если последовательности Chlamydiae разделены на две с последовательностями W. chondrophila с одной стороны и другой последовательностями с другой стороны, что отражает вероятные события латерального переноса генов с другими бактериями, хламидийными последовательностями glgE может по-прежнему быть монофилетическим, поскольку единственный сильно поддерживаемый узел (отмечен красной звездой) с апостериорной вероятностью (pp) выше 0.95 (pp = 0,99) объединяет все последовательности хламидий (рис. 2a), что также было подтверждено с помощью модели LG (дополнительные данные 1). Филогенетический анализ подчеркивает, что последовательности GlgE можно разделить на классы I и II, включая Chlamydiales и Actinomycetales (т.е. микобактерии, Streptomycetes), соответственно. Для филогении Tres-Mak (рис. 2b), хламидийные последовательности Tres-Mak группируются вместе, что указывает на общее происхождение, однако, с низкой статистической поддержкой (pp = 0.93). Хотя происхождение оперона GlgE не может быть точно определено в нашем филогенетическом анализе, возможные сценарии таковы, что либо (i) оперон GlgE отражает рудиментарную метаболическую функцию предковых хламидий, а затем был утерян в большинстве семей, либо (ii) этот оперон был приобретен событие латерального переноса гена от члена типа PVC от общего предка семейств Parachlamydiaceae , Waddliaceae и Criblamydiaceae .

a GlgC- и GlgE-пути представляют собой основные пути биосинтеза гликогена у прокариот. Формирование линейных цепей глюкозильных единиц, соединенных α-1,4 связями, зависит от сопряженного действия активностей АДФ-глюкозопирофосфорилазы (GlgC) / гликогенсинтазы (GlgA) в пути GlgC, тогда как оно зависит от комбинированного действия трегалозосинтазы. (TreS) / мальтокиназа (Mak) / мальтозилтрансфераза (GlgE) в GlgE-пути. Повторение синтеза глюкана и реакции разветвления, катализируемые изоформами разветвленного фермента (GlgB и glgB2), создают разветвленный полисахарид.Глюкозидные связи α-1,4 и α-1,6 катаболизируются за счет синергического действия изоформ гликогенфосфорилазы (GlgP и GlgP2), фермента разветвления (GlgX) и α-1,4-глюканотрансферазы (MalQ) в глюкозу-1. -фосфат и глюкоза. b Филогенное дерево культурных и некультивируемых хламидий. Для каждого вида семейств: a, Ca. Pelagichlamydiaceae ; b, Ca. Paralichlamydiaceae ; c, Ca. Novochlamydiacae ; d, Chlamydiaceae ; e, Simkaniaceae ; f, Ca. Arenachlamydiaceae ; g, Rhabdochlamydiaceae ; ч, ок. Limichlamydiaceae ; я, ок. Enkichlamydiaceae ; j, Ca. Kinetochlamydiaceae ; k, Ca. Motilichlamydiaceae ; l, Waddliaceae ; m, Criblamydiaceae ; n, Parachlamydiaceae , количество черновых (d) или полных (c) геномов и полнота генома, выраженная в процентах, указаны в скобках. Гомологичные гены путей GlgC и GlgE обозначены цветными стрелками.Ген glgP2 был идентифицирован в плазмиде S. negevensis и также присутствует в одном из двух доступных геномов P. neagleriophila .

И филогенетические деревья GlgE ( a ) и TreS-Mak ( b ) были выполнены с Phylobayes в рамках модели Пуассона C20 +. Затем мы сопоставили узлам значения начальной загрузки ML, полученные из 100 повторений начальной загрузки с моделью LG4X (слева) и байесовскими апостериорными вероятностями (справа).Показаны значения начальной загрузки> 50%, в то время как показаны только апостериорные вероятности> 0,6. Деревья имеют средние корни. Chlamydiales отображаются фиолетовым цветом. Масштабная линейка показывает предполагаемое количество аминокислотных замен на сайт.

Классический путь GlgC не функционирует у

Для дальнейшего изучения того, могут ли рекомбинантные белки GlgA – GlgB из E.lausannensis и W. chondrophila являются функциональными, активность гликогенсинтазы в N-концевом домене оценивали путем измерения включения меченой ¹⁴ C-глюкозильной части из ADP- или UDP- ¹⁴ C-глюкозы в гликоген и путем выполнения специфического неденатурирующего PAGE или зимограммы для визуализации активности гликогенсинтазы. После разделения на нативном ПААГ, содержащем гликоген, рекомбинантные белки инкубировали в присутствии 1,2 мМ АДФ-глюкозы или УДФ-глюкозы, активность гликогенсинтазы визуализировалась в виде темных полос активности после вымачивания гелей в растворе йода (рис.3).

Всего неочищенные экстракты рекомбинантных белков GlgA Escherichia coli (GlgA_E.coli), GlgA – GlgB E. lausannensis (GlgA-GlgB_EL) и W. chondrophila (GlgA-GlgB_WC) были разделены. с помощью нативного ПААГ, содержащего 0,6% (мас. / об.) гликогена. Затем нативные гели инкубировали с 1,2 мМ ADP-glc или 1,2 мМ UDP-glc. Активность гликогенсинтазы видна после окрашивания йодом в виде темных полос.

Ферментативные анализы и анализ зимограмм показывают, что домен гликоген-синтазы химерного GlgA-GlgB W. chondrophila (далее GlgA-GlgB-WC) является функциональным, но высокоспецифичным для АДФ-глюкозы (0,70 нмоль включенной глюкозы. Мин. ^-1 мкг ^-1 ) и практически не проявляет активности при использовании UDP-глюкозы в качестве субстрата. Как и предполагалось, активность усеченной гликогенсинтазы в E. lausannensis не была обнаружена в гелях активности или во время ферментативных анализов (дополнительный рис.1а).

Мы далее исследовали, был ли функциональным домен активности ветвления на карбоксильном конце химерного белка GlgA – GlgB W. chondrophila (GlgA – GlgB-WC). Чтобы проверить это, тот же образец химерного GlgA-GlgB-WC, проанализированный ранее, инкубировали с АДФ-глюкозой (3 мМ) и мальтогептаозой (10 мг · мл ^-1 ) в течение ночи. Впоследствии появление точки ветвления (то есть связей α-1,6) на растущих линейных глюканах можно конкретно наблюдать по резонансу протонов на углерод 6 в позиции 4.9 частей на миллион с использованием протонного ЯМР-анализа. Однако, как показано на дополнительном рис. 1c, мы не наблюдали никакого сигнала, предполагая, что домен активности фермента ветвления не является функциональным, несмотря на активный домен гликогенсинтазы. Этот результат согласуется с несколькими сообщениями, указывающими на то, что длина аминокислоты на N-конце фермента ветвления влияет на его каталитические свойства ^25,26,27 . Что касается этой информации, расширение домена гликогенсинтазы, расположенное на N-конце, предотвращает, вероятно, активность фермента ветвления GlgA-GlgB.Таким образом, α-1,6-связи или точки ветвления, вероятно, являются результатом активности изоформы GlgB2, обнаруженной в обоих случаях. В целом, эти данные убедительно подтверждают, что классический путь GlgC не функционирует ни в Waddliaceae , ни в Criblamydiaceae семействах.

GlgE-подобные гены

На основании филогенетического анализа GlgE, как GlgE микобактерий ( Actinobacteria ), так и Chlamydiales , филогенетически далеки друг от друга (рис.2а). GlgE M. tuberculosis демонстрирует 43-40% идентичности с GlgE-подобными последовательностями E. lausannensis и W. chondrophila соответственно. Поскольку активность GlgE принадлежит к большому и разнообразному семейству гликозилгидролазы 13, состоящему из углеводно-активных ферментов с весьма разнообразной активностью, таких как α-амилазы, ферменты разветвления, ферменты разветвления ²⁸ , мы предприняли попытку продемонстрировать, что эти ферменты проявляют каталитические свойства, аналогичные свойствам ранее описано для GlgE микобактерий.Меченные гистидином рекомбинантные белки GlgE Estrella lausannensis (далее GlgE-EL) и Waddlia chondrophila (далее GlgE-WC) были экспрессированы и дополнительно охарактеризованы (дополнительный рисунок 2). Как описано в предыдущих исследованиях, GlgE Mycobacteria опосредует обратимую реакцию, состоящую из высвобождения мальтозо-1-фосфата в присутствии ортофосфата и полисахарида α-глюкана. И GlgE-EL, и GlgE-WC инкубировали в присутствии гликогена из печени кролика и ортофосфата.После инкубации в течение ночи продукты реакции анализировали с помощью тонкослойной хроматографии и опрыскивали орицинол-серной кислотой (рис. 4а). Продукт быстрой миграции, способный взаимодействовать с орцинол-серной кислотой, был четко синтезирован в неочищенном экстракте (CE), при промывании №3 (W3) и во фракции очищенного фермента (E1) образца GlgE-EL. Едва заметный продукт наблюдается только в очищенной фракции (E1) GlgE-WC. Соединение, продуцируемое GlgE-EL в присутствии гликогена и ортофосфата, было дополнительно очищено с помощью различных стадий хроматографии и подверглось масс-спектрометрии и анализу протонного ЯМР (рис.4б, в). Комбинация этих подходов подтверждает, что GlgE E. lausannensis , а также W. chondrophila (дополнительный рис. 3) катализирует образование соединения с молекулярной массой 422 Да (рис. 4c), соответствующего α- мальтозо-1-фосфат, как показано на протонном и фосфорном спектрах (рис. 4b). Чтобы провести ферментативную характеристику активности GlgE, идентичные процессы очистки были увеличены для очистки достаточного количества M1P, свободного от неорганического фосфата и глюкана.

a Оба гистидиновых рекомбинантных белка GlgE-EL и GlgE-WC очищали и инкубировали в присутствии гликогена и неорганического фосфата. Продукты реакции в течение ночи из неочищенного экстракта (CE), ферментов, очищенных на третьей стадии промывки (W3) (E1), подвергали анализу с помощью тонкослойной хроматографии. Орцинол-серный спрей показывает заметную продукцию M1P с рекомбинантным GlgE-EL, которая менее заметна с рекомбинантным GlgE-WC.b Часть 1D- ¹ H-ЯМР-спектр мальтозид-1-фосфата. Конфигурация α-аномеров обоих глюкозильных остатков характеризовалась их типичными гомоядерными константами вицинального взаимодействия ( ³ J _{h2A, h3A} и ³ J _{h2B, h3B} ) со значениями 3,5 и 3,8 Гц, соответственно. Дополнительная константа взаимодействия наблюдалась для α-аномерного протона остатка A, как показано присутствием характерного дублета при 5.47 частей на миллион. Эта дополнительная константа связи обусловлена ​​гетероядерной вицинальной корреляцией ( ³ J _{h2A, P} ) между аномерным протоном остатка A и атомом фосфора фосфатной группы, что указывает на то, что фосфатная группа, несомненно, была связана с O на первый углерод конечного восстанавливающего глюкозильного звена A. Значение этого ³ J _{h2A, P} было измерено при 7,1 Гц (таблица 1). c Профиль секвенирования MS-MS M1P.Молекулярный ион [M + 2Na] ⁺ при m / z 466,7, соответствующий M1P + 2 натрия, фракционировали на различные ионы. Распределение пиков было определено в соответствии с панелью, инкрустированной в ( c ).

Кинетические параметры активности GlgE

Поскольку рекомбинантный GlgE-WC с гист-меткой экспрессируется очень плохо, а удельная активность GlgE-WC была в десять раз ниже, чем GlgE-EL, кинетические параметры определяли в направлении синтеза, т. е. перенос (количество) мальтозильных фрагментов на невосстанавливающих концах глюкановых цепей, исключительно для GlgE-EL. Реакции переноса связаны с высвобождением неорганического фосфата, который можно легко контролировать с помощью чувствительного анализа малахитового зеленого.Таким образом, при переменных концентрациях M1P и при фиксированных концентрациях гликогена или мальтогептаозы активность GlgE-EL демонстрирует аллостерическое поведение, указывающее на положительную кооперативность, что подтверждается коэффициентами Хилла, которые были выше 1 (рис. 5a, b). В соответствии с этим, молекулярная масса нативного GlgE-EL, определенная либо с помощью эксклюзионной хроматографии, либо с помощью нативного PAGE, содержащего различные концентрации акриламида (5, 7,5, 10 и 12,5%), указывает на кажущуюся молекулярную массу 140–180 кДа, соответственно, что соответствует образованию димеров, тогда как мономеры массой 75 кДа не наблюдались (рис.5д, е). Фермент показал значения S _0,5 для M1P, которые варьируются от 0,16 ± 0,01 мМ до 0,33 ± 0,02 мМ, если DP7 и гликоген являются акцепторами глюкана, соответственно. Однако при использовании M1P в насыщающей концентрации GlgE-EL отображает кинетику Михаэлиса ( n ​​ _H близко к 1), указывая на некооперативную реакцию (рис. 5c, d). В таких экспериментальных условиях кажущиеся значения K _m для гликогена и DP7, 2,5 ± 0,2 мг / мл ^-1 и 3,1 ± 0,2 мМ, соответственно, были аналогичны кажущемуся значению K _m гликогенсинтаза (GlgA), которая синтезирует α-1,4 связи из АДФ-глюкозы ²⁹ .

Активность GlgE анализировали спектрофотометрически, отслеживая высвобождение неорганического ортофосфата (Pi). Данные представлены в виде отдельных точек данных n ​​ независимых экспериментов. Графики насыщения M1P для GlgE-EL были определены в присутствии 10 мМ мальтогептаозы (DP7) ( n ​​ = 3) ( a ) или 10 мг / мл ^-1 гликогена ( n ​​ = 3). ( b ). При низких концентрациях M1P (панели) активность GlgE-EL ведет себя как аллостерический фермент с коэффициентами Хилла ( n ​​ _H ), равными 1.6 и 1,5, соответственно (соответствие показано сплошной линией, что дает r ² = 0,98). Значения S _0,5 (M1P) для GlgE-EL были определены при 0,33 ± 0,02 мМ и 0,16 ± 0,01 мМ в присутствии DP7 и гликогена, соответственно. В присутствии 2 мМ M1P графики насыщенности DP7 ( n ​​> 3) ( c ) и гликогена ( n ​​ = 2) ( d ) соответствуют поведению Михаэлиса-Ментен ( n ​​). _H близко к 1) с K _м значениями 3.1 ± 0,2 мМ и 2,5 ± 0,2 мг / мл ⁻¹ соответственно. Кажущуюся молекулярную массу GlgE-EL определяли с помощью нативного PAGE ( e ) и эксклюзионной хроматографии (Superose 6 Increase GL 10/300) ( f ) при 140,9 и 180 кДа соответственно, что позволяет предположить наличие димера GlgE. (76 кДа).

Синтез гликогена De novo: активность GlgE способствует инициации и удлинению глюкана

В отличие от эукариотической гликогенсинтазы, прокариотической гликогенсинтазе (GlgA) не требуется присутствие короткого α-1,4-глюкана или праймера для инициирования биосинтез гликогена ¹⁰ .В отсутствие активности GlgA и GlgC у E. lausannensis и в отсутствие GlgC и, следовательно, поставки АДФ-глюкозы в W. chondrophila возникает вопрос о способности активностей GlgE замещать GlgA в отношении праймирование биосинтеза гликогена. Чтобы установить, способны ли активности GlgE стимулировать синтез глюкана, были использованы как His-tagged GlgE-EL (3,51 нмоль Pi высвобожденного. Min ^-1 ), так и GlgE-WC (1,38 нмоль Pi высвобожденного. Min ^-1 ). инкубировали с 1.6 мМ M1P в присутствии 5 мМ различных цепей глюкана со степенью полимеризации (DP) от 1 до 7. Идентичные эксперименты по инкубации были проведены с рекомбинантными белками GlgE, за исключением того, что M1P был опущен, чтобы оценить α-1,4-глюканотрансферазу. или диспропорционирующая активность (фиг. 6 и дополнительные фиг. 4 и 5).

a , час Спонтанное дефосфорилирование M1P во время инкубации в течение ночи оценивали путем инкубации денатурированных ферментов GlgE в буфере, содержащем 1.6 мМ M1P. Перенос мальтозильных фрагментов из M1P в концентрации 1,6 мМ на невосстанавливающие концы акцепторов глюкана (5 мМ) определяли в отсутствие акцептора глюкана, DP0 ( b , i ) или в присутствии глюкозы, DP1 ( c , j ), мальтотриоза, DP3 ( d , k ), мальтотетраоза, DP4 ( e , l ) и мальтогептаоза, DP7 ( f , m ). г , n α-1,4-глюканотрансферазные активности GlgE определяли путем инкубирования 5 мМ мальтогептаозы DP7 без мальтозо-1-фосфата.Цифры над пиками флуоресценции представляют степень полимеризации глюкановых цепей.

После инкубации восстановленные концы глюкановых цепей метили флуоресцентным заряженным зондом (APTS) и разделяли в соответствии со степенью полимеризации с помощью капиллярного электрофореза. Мы заметили, что C1-фосфатная группа препятствует мечению M1P флуоресцентным зондом. Тем не менее, уровень мальтозы, высвобождаемой из M1P в результате спонтанного дефосфорилирования во время эксперимента, был оценен путем проведения инкубации с денатурированными ферментами (рис.6а, з). Эксперименты по инкубации показывают, что обе активности GlgE обладают активностью α-1,4-глюканотрансферазы или мальтозилтрансферазы в зависимости от присутствия M1P. Когда M1P опущен, активности GlgE обладают активностью α-1,4-глюканотрансферазы исключительно с глюканами, состоящими из шести или семи единиц глюкозы (DP6 или DP7). Интересно, что после 1 ч или инкубации в течение ночи DP6 или DP7 диспропорционируют с одним или двумя мальтозильными фрагментами, что приводит к высвобождению более коротких (DPn-2) и более длинных глюканов (DPn + 2) (рис.6g, n и дополнительные фиг. 4 и 5). Ограниченное количество реакций переноса указывает, вероятно, на побочную реакцию активности GlgE. Активность α-глюканотрансферазы также можно оценить на нативном ПААГ, содержащем гликоген. Модификация длины цепи внешних глюкановых цепей гликогена приводит к увеличению взаимодействий с йодом, визуализируемых в виде коричневатой полосы активности (дополнительный рис. 6a). После 1 ч инкубации (дополнительные рисунки 4 и 5) обе активности GlgE позволяют переносить мальтозильный фрагмент M1P на праймер глюкана с DP ≥ 3 (рис.6d – f, k – m и дополнительные рис. 4 и 5). Интересно, что в течение более длительного периода инкубации обе активности GlgE ведут себя как процессивные или распределительные ферменты, в зависимости от начальной степени полимеризации глюканового праймера. Процессивное поведение ферментов GlgE было неожиданным, поскольку сообщалось, что активность GlgE управляет реакцией двойного вытеснения (то есть механизмом Пинг-Понга), включающим высвобождение (2 + n) глюкана до следующей реакции ¹⁸ . Как показано на рис.6, синтез очень длинных цепей глюкана, до 32 остатков глюкозы, предполагает, что как GlgE-EL, так и GlgE-WC подвергаются активностям удлинения, подобным процессивному, в присутствии мальтозы (DP2) или мальтотриозы (DP3). Напротив, когда обе активности GlgE инкубируются в присутствии глюкановых праймеров с DP ≥ 4, последние добавляют и немедленно высвобождают глюкановый праймер (DP) с приращением двух глюкозных фрагментов (DPn + 2), что приводит к поведению распределительного удлинения. . Механизм, лежащий в основе переключения между процессивно-подобной и распределительной активностями удлинения, отражает, вероятно, конкуренцию глюкановых праймеров за сайт связывания глюкана в непосредственной близости от каталитического домена.Таким образом, мы можем предположить, что низкое сродство коротких праймеров глюкана (DP <4) к сайтам связывания глюкана способствует, вероятно, итеративным реакциям трансферазы на один и тот же акцепторный глюкан (то есть процессивно-подобному режиму), приводящему к синтезу длинных цепей глюкана, тогда как праймеры глюкана с DP ≥ 4 сильно конкурируют за сайт связывания, что приводит к распределительному режиму. Несоответствие между GlgE-EL и GlgE-WC для синтеза длинных цепей глюкана в отсутствие (рис. 6b, i) или в присутствии глюкозы (DP1) (рис.6c, j) можно объяснить более высоким количеством свободной мальтозы, наблюдаемым в образцах денатурированного GlgE-WC (фиг. 6a) по сравнению с образцами денатурированного GlgE-EL (фиг. 6h). Несмотря на принятие всех мер предосторожности (тот же препарат M1P, буфер pH 7), спонтанное дефосфорилирование M1P происходило более значительно в образцах GlgE-WC. Таким образом, мы заключаем, что первоначальные следы мальтозы в образцах GlgE-WC способствуют синтезу длинных цепей глюкана в отсутствие (рис. 6b) или в присутствии глюкозы (DP1) (рис.6в). Чтобы проверить эту гипотезу, неочищенный экстракт (CE) и очищенные белки GlgE (E1) из E. lausannensis загружали в неденатурирующий полиакриламидный электрофорез (нативный PAGE). После миграции срезы полиакриламидного геля инкубировали в течение ночи в буферах, содержащих 0 мМ (контроль) или 2 мМ M1P (фиг. 7a). Синтез длинных цепей глюкана с DP> 15 (минимальное количество единиц глюкозы, необходимое для обнаружения посредством взаимодействия с молекулами йода) обнаруживается путем вымачивания геля в растворе йода.Как показано на фиг. 7a, синтез глюкановых цепей, катализируемый GlgE-EL, проявляется исключительно в виде темно-синих полос активности внутри нативного PAGE, инкубированного с 2 мМ M1P, а не в отсутствие M1P.

a Активность рекомбинантного GlgE Estrella lausannensis из неочищенного экстракта E. coli (CE) и очищенная на никелевой аффинной колонке (E1) загружали в неденатурирующий полиакриламидный гель.После миграции срезы нативного PAGE инкубировали в буфере TRIS / ацетат, содержащем 2 мМ мальтозо-1-фосфата (M1P), в течение 16 часов при 25 ° C. Синтез цепей глюкана de novo визуализируется в виде темно-синих полос из-за образования глюкан-йодных комплексов. Аналогичные эксперименты in vitro проводили путем добавления активности GlgB W. chondrophila к трис / ацетатному буферу, содержащему активность GlgE и 2 мМ M1P. После инкубации в течение ночи реакционную смесь подвергали анализу ¹ H-ЯМР. b Часть спектра ¹ H-ЯМР мальтозо-1-фосфата (M1P), неочищенной реакционной смеси и гликогена (gly) из бычьей печени в D ₂ O. Пик № 1 (5,45–5,3 м.д.) и пик №2 (4,98 м.д.) представляют собой сигналы протонов, участвующих, соответственно, в α-1,4- и α-1,6-связях, в то время как пик №3 (5,47 м.д.) представляет собой характерный дублет дублетных сигналов α- аномерный протон, расположенный на C1 мальтозо-1-фосфата. Появление пика №2 и пика №3 в продукте инкубации указывает на образование разветвленных полисахаридов, состоящих из α-1,4- и α-1,6-связей.Наличие пика № 3 предполагает, что M1P не был полностью полимеризован под действием GlgE-активности EL. Затем α-полисахариды очищали (подробности см. в разделе «Методы») и инкубировали с коммерческим ферментом разветвления изоамилазного типа. После инкубации в течение ночи, линейные цепи глюкана, высвобожденные из α-полисахаридов ( c ), и гликоген из бычьей печени, использованный в качестве эталона ( e ), были разделены в соответствии со степенью полимеризации с помощью капиллярного электрофореза в сочетании с флуоресцентной маркировкой восстановленных веществ. заканчивается.В качестве контроля образцы α-полисахарида ( d ) и гликогена ( f ) были непосредственно помечены и проанализированы капиллярным электрофорезом для оценки содержания свободных линейных цепей глюкана.

В целом, эти результаты предполагают, что активности GlgE способны синтезировать de novo достаточное количество длинных линейных глюканов из мальтозо-1-фосфата. Мы не можем исключить роль мальтозы в инициировании процесса синтеза глюкана в качестве акцептора глюкана, поскольку спонтанное дефосфорилирование M1P неизбежно.Далее мы провели серию экспериментов, которые заключались в синтезе высокомолекулярных разветвленных глюканов in vitro путем инкубации как рекомбинантного фермента разветвления гликогена W. chondrophila (GlgB-WC: дополнительный рис. 6b), так и GlgE-EL в присутствии M1P. . После инкубации в течение ночи непосредственно измеряли появление α-1,6-связей или точек ветвления, подвергая продукт инкубации протонному ЯМР-анализу (фиг. 7b). По сравнению с M1P и гликогеном в качестве контролей, спектр протонного ЯМР продуктов инкубации показывает типичный гликоген-подобный профиль с сигналами на 5.6 и 4,9 м.д. протона, вовлеченного в связи α-1,4 и α-1,6. Этот разветвленный полисахаридный материал был дополнительно очищен и инкубирован с коммерческим ферментом разветвления типа изоамилазы (Megazyme), который отщепляет α-1,6-связи или точки разветвления. Высвободившиеся линейные цепи глюкана метили APTS и разделяли в соответствии со степенью полимеризации с помощью капиллярного электрофореза. Распределение длины цепи (CLD) синтезированных полисахаридов (рис. 7c) сравнивали с гликогеном из бычьей печени (рис.7д). В качестве контроля количество свободных линейных глюканов оценивали путем анализа образцов, меченных APTS, не инкубированных с коммерческим ферментом разветвления (рис. 7d, f). В отсутствие заметного количества свободных цепей глюкана (рис. 7d) синтезированный in vitro полисахарид имеет типичный CLD, подобный гликогену животных с мономодальным распределением и мальтогексаозе (DP6) как наиболее распространенным цепям глюкана. В целом, эти результаты подтверждают, что активность GlgE проявляет in vitro функцию, аналогичную функции гликогенсинтазы (GlgA), для инициирования и удлинения растущих частиц гликогена.

Экспрессия бифункционального TreS-Mak

Насколько нам известно, характеристика бифункциональной активности TreS-Mak еще не описана в литературе. Белок TreS-Mak, меченный гистами, очищенный на никелевых колонках, показывает молекулярную массу 115 кДа на SDS-PAGE (дополнительный рис. 7a), тогда как в растворе рекомбинантный TreS-Mak образовывал гомодимер с кажущейся молекулярной массой 256 кДа, как было проанализировано с помощью колоночная хроматография superose 6 (дополнительный рис.7б). Это контрастирует с гетерооктамерным комплексом, состоящим из четырех субъединиц TreS и четырех субъединиц Mak (≈490 кДа), наблюдаемого в Mycobacterium smegmatis , в котором гомотетрамеры TreS образуют платформу для рекрутирования димеров Mak через специфический домен взаимодействия ^{30, 31} .

Сначала мы подтвердили, что TreS-домен на N-конце является функциональным, путем измерения взаимного превращения трегалозы в мальтозу (подробности см. В разделе «Методы»). Предыдущие сообщения показали, что активность TreS частично или полностью ингибируется 10 мМ двухвалентного катиона, в то время как концентрация 1 мМ имеет положительный эффект.Влияние катиона Mn ²⁺ на активность TreS-домена предполагалось при 200 мМ трегалозы. Как показано на фиг. 8a, активность TreS домена увеличивается лишь незначительно в 1,1 раза от 0 до 1 мМ Mn ²⁺ (0,37 мкмоль мальтозы. Min ^-1 мкг ^-1 ), тогда как заметное снижение активности TreS (0,24 мкмоль мальтозы. мин. ^-1 . мг ^-1 ) достигается при 10 мМ Mn ²⁺ . Как сообщается в литературе, активность TreS также связана с высвобождением глюкозы во время взаимного превращения трегалозы в мальтозу.Поскольку активность TreS слит с доменом Mak в E. lausannensis , мы проверили влияние широкого диапазона концентраций АТФ на взаимное превращение трегалозы (фиг. 8b). Хотя не наблюдалось заметного эффекта АТФ на активность TreS при 1 мМ (0,43 мкмоль мальтозы. Мин ^-1 мкг ^-1 ), активность TreS снижалась в 0,6 раза при 3-10 мМ АТФ (0,29 мкмоль мальтозы. min ^-1 мкг ^-1 ) и упала в 2,8 раза, когда концентрация АТФ достигает 20 мМ (0.15 мкмоль мальтозы. мин ^-1 . мг ^-1 ). Наконец, кажущееся значение K _m для трегалозы было определено при 42,3 ± 2,7 мМ в присутствии 1 мМ MnCl ₂ и 0 мМ АТФ (фиг. 8c). Это согласуется с очевидными значениями K _m для трегалозы (50–100 мМ), сообщенными в литературе для активности TreS у различных видов ³² . Мы также сосредоточили внимание на активности домена мальтокиназы, который катализирует фосфорилирование мальтозы в присутствии АТФ и высвобождает M1P и ADP.За последним наблюдали ферментативно с помощью анализа пируваткиназы для экспрессии домена активности Mak в виде мкмоль высвобожденного АДФ. Мин. ^-1 мкг ^-1 белка. Оптимумы pH и температуры были определены соответственно при 42 ° C и pH 8 (дополнительный рис. 7c, d). Интересно, что активность Mak домена функционирует в широком диапазоне температур, который, вероятно, отражает температуру свободноживущих амеб или животных-хозяев. Сообщается об активности киназ в связи с их потребностью в двухвалентном катионе для стабилизации отрицательно заряженных фосфатных групп доноров фосфата, таких как АТФ.Таким образом, активность TreS-Mak была сделана в присутствии различных двухвалентных катионов (рис. 8e). Как и ожидалось, рекомбинантный TreS-Mak строго зависел от двухвалентных катионов, в частности, с заметным стимулирующим эффектом Mn ²⁺ (рис. 8d, e). Другие тестировали двухвалентные катионы, такие как Co ²⁺ , Mg ²⁺ , Fe ²⁺ , Ca ²⁺ , Cu ²⁺ , также активировали активность Mak, но в меньшей степени, в то время как нет Эффект наблюдался в присутствии Ni ²⁺ .Интересно, что в отличие от активности Mak Mycobacterium bovis , которая предпочитает Mg ²⁺ , каталитический сайт домена активности Mak TreS-Mak связывает преимущественно Mn ²⁺ , а не Mg ^{2+ 33} , что согласуется с отчетливой эволюционной историей, изображенной на рис. 2b. Затем нуклеотиды, АТФ, CTP, GTP и UTP были протестированы в качестве доноров фосфата путем измерения количества высвобожденного M1P (рис. 8f). Данные, выраженные в процентах активности, показывают, что АТФ (100%), GTP (85%), UTP (70%) и в меньшей степени CTP (31%) являются эффективными донорами фосфата.В целом, мы продемонстрировали, что TreS и Mak домены функциональны в слитном белке TreS-Mak E. lausannensis . Обратимое взаимное превращение трегалозы в сочетании с внутриклеточной концентрацией трегалозы, вероятно, ниже 42 мМ (внутриклеточная концентрация трегалозы была оценена в 40 ± 10 мМ внутри одной клетки штамма E. coli , сверхэкспрессирующего OtsA / OtsB ³⁴ ), предполагает, что необратимое фосфорилирование мальтоза стимулирует синтез M1P.

a Активность трегалозосинтазного домена (TreS) бифункционального белка TreS-Mak сначала оценивали при 30 ° C, pH 8, с 200 мМ трегалозы в присутствии 0, 1 и 10 мМ хлорида марганца (MnCl _2). ). Взаимное превращение трегалозы в мальтозу и последующее высвобождение глюкозы (красный цвет) предполагалось с использованием метода анализа амилоглюкозидазы. Активность TreS выражается в мкмоль мальтозы / мин / мг белка. b Влияние нуклеозидтрифосфата на активность TreS определяли путем измерения взаимного превращения трегалозы в мальтозу в присутствии возрастающих концентраций АТФ (0–20 мМ) и 200 мМ трегалозы. c Кажущееся значение K _m ( n ​​ = 3) для трегалозы определяли в отсутствие АТФ и 1 мМ MnCl ₂ путем измерения взаимного превращения увеличения концентрации трегалозы (0–200 мМ ) в мальтозу. d Домен мальтокиназной активности был выведен путем измерения высвобождения АДФ во время фосфорилирования мальтозы (20 мМ) в M1P в присутствии 0, 1, 3 и 10 мМ MnCl ₂ .Активность Mak выражается в мкмоль высвобожденного АДФ / мин / мг белка. e Влияние двухвалентного катиона Mn ²⁺ , Ni ²⁺ , Co ²⁺ , Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ca ²⁺ и Mg ²⁺ при 10 мМ и f нуклеотидов АТФ, CTP, GTP и UTP на активность Mak определяли и выражали как относительный процент от максимальной активности. Данные представлены в виде отдельных точек данных с полосой погрешности, обозначающей стандартное отклонение n ​​ ≥ 3 независимых экспериментов.

Описанные выше эксперименты по инкубации показали, что разветвленный полисахарид может быть синтезирован in vitro в присутствии мальтозо-1-фосфата и как GlgE, так и GlgE. виды деятельности. Это побудило нас изучить наличие частиц гликогена в шлифе E. lausannensis и W.chondrophila с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Через 24 часа после заражения обоими Chlamydiales (рис. 9a, c) мы очистили элементарные тельца (рис. 9b, d) из инфицированных культур Acanthamoeba castellanii и подвергли их специфическому окрашиванию гликогеном на основе метода периодической кислоты. , который считается одним из самых надежных и специфичных методов окрашивания гликогена ³⁵ . Частицы гликогена появляются как электронно-плотные частицы (белые стрелки) в цитозоле элементарных тел E.lausannensis и W. chondrophila . Интересно, что поскольку Waddlia chondrophila инфицирует клетки животных, которые не синтезируют трегалозу, это предполагает, что трегалоза должна синтезироваться самими бактериями ³⁶ . Основываясь на пяти различных путях трегалозы, описанных у прокариот (для обзора см. Ref. ³⁷ ), мы обнаружили, что биосинтез трегалозы ограничен так называемыми «экологическими Chlamydiae » и не присутствует в семействе Chlamydiaceae .Среди штаммов хламидий с путем GlgE P. phocaeensis и P. neagleriophila синтезируют трегалозу через путь TreY-TreZ, в то время как путь OtsA-OtsB был обнаружен как в E. lausannensis , так и в W. chondrophila . Важно отметить, что гены otsA, и otsB кодируют трегалозо-6-фосфатсинтазу и трегалозо-6-фосфатфосфатазу соответственно. Активность OtsA конденсирует глюкозо-1-фосфат и UDP-глюкозу в трегалозо-6-фосфат.Однако поиск BLAST не подтвердил наличие классического гена galU , кодирующего UDP-глюкозопирофосфорилазу, который синтезирует UDP-глюкозу из глюкозо-1-фосфата и UTP как в E. lausannensis , так и в W. chondrophila , а скорее в не -GalU типа UDP-глюкозопирофосфорилаза, гомолог UGP3 растений ³⁸ . Основываясь на этой работе и принимая во внимание текущий анализ генома, мы предполагаем, что путь метаболизма гликогена у W. chondrophila и E.lausannensis встречаются, как показано на рис. 10.

частицы гликогена (белые стрелки) в E. lausannensis ( a , b ) и W. chondrophila ( c , d ) наблюдались с помощью ТЕА после периодической кислоты тиокарбогидразид-протеинат серебра. окрашивание ультратонких срезов через 24 часа после заражения A.castellanii с E. lausannensis ( a ) и W. chondrophila ( c ) или очищенными бактериями ( b , d ).

Глюкозо-6-фосфат (G-6-P) и UTP / ATP транспортируются в цитозоле через транслокаторы Uhpc и NTT. Первый обязательный этап состоит из изомеризации G-6-P в глюкозо-1-фосфат (G-1-P), катализируемой активностью глюкозо-6-фосфат-изомеразы (MrsA).UDP-глюкозопирофосфорилаза (UGP3) синтезирует UDP-глюкозу из G-1-P и UTP. И трегалозо-6-фосфатсинтаза (OtsA), и трегалозо-6-фосфатфосфатаза (OtsB) превращают нуклеотид-сахар и G-6-P в трегалозу. Бифункциональная активность TreS-Mak обеспечивает активность мальтозилтрансферазы (GlgE) в мальтозо-1-фосфате (M1P). De novo свойства глюкана в отношении инициирования и удлинения GlgE и активности фермента ветвления (GlgB) делают возможным появление α-полисахарида (т. Е. Гликогена), состоящего из α-1,4- и α-1,6-связей.Синергическое действие гликогенфосфорилазы (GlgP), фермента разветвления (GlgX) и α-1,4-глюканотрансферазы (MalQ) деполимеризует гликоген в G-1-P и короткие мальтоолигосахариды (MOS). Первый питает как окислительный пентозофосфат (OPP), так и пути Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), которые поставляют внеклеточные формы (элементарные тельца) в пониженной мощности (NADPH, H +) и ATP, соответственно. Двухвалентные катионы Mn ²⁺ , необходимые для активности TreS-Mak, вероятно, импортируются через транспортер ABC, состоящий из субъединиц MntA, MntB и MntC 3, идентифицированных в геномах хламидий. Waddliaceae и Criblamydiaceae могут манипулировать углеродным пулом хозяина, поглощая трегалозу через предполагаемый переносчик дисахаридов (оранжевая / пунктирная стрелка) или секретируя ферменты, метаболизирующие гликоген, через систему секреции третьего типа (зеленая / пунктирная стрелка).

Структура и функция гликогена

Основные запасы гликогена находятся в скелетных мышцах и печени, хотя большинство других клеток хранят небольшие количества гликогена для собственного использования.

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИЯ ГЛИКОГЕНА

Основные магазины гликоген содержится в скелетных мышцах и печени, хотя большинство других клеток хранить небольшое количество гликогена для собственного использования.Функция мышцы гликоген должен служить топливным резервом для синтеза аденозина трифосфат (АТФ) во время сокращения мышц. Гликоген печени должен поддерживать концентрацию глюкозы в крови, особенно на ранних стадиях поста (рисунок 11.2;). [Примечание: гликоген печени может поддерживать уровень глюкозы в крови в течение 10–18 часов]

Рис. 11.2 Функции гликогена в мышцах и печени. P = фосфат; Pi = неорганический фосфат.

Примерно 400 г гликоген составляет 1–2% от свежего веса мышц в состоянии покоя, и примерно 100 г гликогена составляют до 10% сырой массы сытой печени взрослого человека. Что ограничивает производство гликогена на этих уровнях, не ясно. Тем не мение, при некоторых болезнях накопления гликогена ([GSD] см. рис. 11.8) количество гликоген в печени и / или мышцах может быть значительно выше. [Примечание: в тела, мышечная масса больше массы печени.Следовательно, большая часть тела гликоген находится в мышцах.]

Гликоген — это полисахарид с разветвленной цепью, полученный исключительно из α-D-глюкозы. Главная гликозидная связь представляет собой связь α (1 → 4). В среднем после восьми-десяти глюкозил остатков, существует ветвь, содержащая связь α (1 → 6) (рис. 11.3). А одна молекула гликогена может иметь молекулярную массу до 108 Да.Эти полимеры глюкозы существуют в дискретных цитоплазматических гранулах, которые также содержат большинство ферментов, необходимых для синтеза и распада гликогена.

Рис. 11.3 Разветвленная структура гликогена с гликозидными связями α (1 → 4) и α (1 → 6).

Запасы гликогена в печени увеличиваются во время сытого состояния и истощаются во время голодания.Мышцы гликоген не подвержен влиянию коротких периодов голодания (несколько дней) и только умеренно снижается при длительном голодании (нед.). Мышечный гликоген синтезируется для пополнения запасов мышц после того, как они были истощены после физическая нагрузка. [Примечание: синтез и разложение гликогена продолжаются непрерывно. Различия между скоростями этих двух процессов определить уровни запасенного гликогена при определенных физиологических состояниях.]

Роль инсулина, глюкозы и гликогена в диабете

Сахарный диабет, обычно называемый диабетом, вызывается недостаточным количеством циркулирующего в организме инсулина и является важным заболеванием для специалистов по неотложной медицинской помощи и тех, кто хочет получить степень в области неотложной медицинской помощи.Чтобы полностью понять, как работает диабет, давайте немного поговорим о физиологии. Если вы изучите слово «метаболизм» и его греческие корни, вы узнаете, что оно означает «изменяться».

Метаболизм в организме — это не что иное, как расщепление или превращение глюкозы в энергию в форме АТФ с побочными продуктами диоксида углерода и воды. Когда пациент ест, уровень глюкозы в крови повышается. Инсулин — это привратник, который позволяет клеткам использовать молекулы глюкозы в крови.Когда уровень глюкозы в крови низкий, глюкагон является основной формой гормона, который заставляет организм выделять запасенный гликоген или энергию.

Чтобы организм вырабатывал энергию, инсулин должен позволять глюкозе проникать в клетку. Если инсулина нет, количество глюкозы, которая может попасть в клетки, слишком мало для удовлетворения ежедневных потребностей организма в энергии. Для этого должно быть достаточное количество инсулина, и инсулин должен работать правильно, чтобы глюкоза могла перемещаться в клетку.

Диабет — распространенное заболевание, с которым обращаются к специалистам скорой медицинской помощи, и основная причина смерти в Соединенных Штатах. Это происходит из-за нехватки инсулина или неспособности организма эффективно использовать инсулин. Сахарный диабет обычно классифицируют как тип I или тип II. В прошлом диабет I типа был также известен как инсулинозависимый сахарный диабет или просто ювенильный диабет. Это потому, что диабет I типа почти всегда проявлялся до того, как человек вступил в подростковый возраст.Диабет II типа был назван инсулиннезависимым сахарным диабетом или диабетом взрослого возраста. По данным Американской диабетической ассоциации, диабет II типа — это болезнь образа жизни. Давайте рассмотрим каждый из этих типов диабета.

Когда организм функционирует нормально, уровень глюкозы в крови, также известный как BGL, находится в диапазоне 60–120 миллиграммов на децилитр. Если пациент голодает после полуночи, его уровень глюкозы в крови должен упасть до менее 100. На уровень глюкозы влияет не только количество съеденной пищи, но и тип потребляемой пищи.Основные компоненты пищи — это белки, жиры и углеводы. Каждое из этих веществ усваивается организмом с разной скоростью.

Продукты с высоким содержанием углеводов обеспечивают самый быстрый источник энергии для организма. Как только они съедены, бета-клетки поджелудочной железы немедленно выделяют инсулин. Этот гормон соединяется со специфическими рецепторами на поверхности клетки, что позволяет глюкозе проникать в нее. У этого двоякая цель. Во-первых, он позволяет клеткам получать доступ к глюкозе для метаболизма, а, во-вторых, обеспечивает уверенность в том, что организму не придется зависеть от белков или жиров для метаболизма.Избыточная глюкоза загружается в печень, где она превращается в гликоген и хранится в ней. Даже если вы думаете, что после употребления большого количества углеводов уровень сахара в крови резко возрастет, этого обычно не происходит, поскольку высвобождение инсулина гарантирует, что глюкоза будет доступна для немедленного использования или хранения.

Печень ограничена в количестве гликогена, который может там храниться, поэтому мышцы будут помогать этому процессу. Подсчитано, что до трети глюкозы, которая проходит через печень, превращается в жирные кислоты, которые затем откладываются в жировой или жировой ткани в виде триглицеридов.Если инсулин недоступен для нормального метаболизма, этот жир расщепляется и превращается в растворимую форму, которая содержится в крови. Это причина того, почему низкий уровень инсулина обычно сопровождается высоким уровнем холестерина и триглицеридов, которые сопровождают это состояние. Это часто приводит к сердечным заболеваниям — еще одной распространенной проблеме со здоровьем, с которой сталкиваются сотрудники службы неотложной медицинской помощи.

Гормон роста и инсулин работают вместе, перемещая аминокислоты через клеточную мембрану. Там они расщепляются с образованием новых белков.Этот процесс известен как синтез белка. При недостаточном количестве инсулина хранение белка затрудняется, и начинается распад мышечного белка. Неиспользуемый белок, известный как «белковая потеря», отправляется в почки и выводится с мочой. Большое количество белка, проходящего через почки, может привести к почечной недостаточности и диализу.

В прошлом диабет был необычным заболеванием даже среди поставщиков неотложной медицинской помощи. Сегодня многие врачи считают, что от 10 до 12 процентов населения Америки страдают диабетом.Чтобы узнать больше о диабете и патофизиологии эндокринной системы, послушайте 10 Minute Medic, подкаст координатора скорой медицинской помощи EKU доктора Билла Янга.

Управление диабетом и знание того, на что обращать внимание, — важные темы для специалистов скорой медицинской помощи. Если вы являетесь лицензированным фельдшером и заинтересованы в получении степени младшего специалиста или бакалавра в области неотложной медицинской помощи, заполните форму выше, чтобы узнать больше.

Как студент EKU Online, желающий получить степень в области неотложной медицинской помощи, вы изучите новейшие процедуры и важные навыки для продвижения своей карьеры в области оказания неотложной медицинской помощи и обеспечения конкурентного преимущества на рынке труда.EKU — это университет, аккредитованный SACSCOC, который уже более 15 лет является лидером в области онлайн-образования.

Свяжитесь с нами сегодня, чтобы начать.

Метаболизм гликогена — Knowledge @ AMBOSS

Последнее обновление: 27 августа 2021 г.

Резюме

Гликоген является важным сложным полимером, состоящим из нескольких цепей молекул глюкозы. Он присутствует во всех типах клеток, за исключением эритроцитов. Большая часть гликогена в организме хранится в печени и скелетных мышцах.Полностью восполненные запасы гликогена могут обеспечивать уровень глюкозы в крови примерно на 12–48 часов во время голодания. Метаболизм гликогена в первую очередь регулируется инсулином, глюкагоном и адреналином. Инсулин увеличивает гликогенез и снижает гликогенолиз в печени и мышцах; глюкагон и адреналин снижают гликогенез в печени и усиливают гликогенолиз в печени и мышцах.

Обзор

• Функция: гликоген является наиболее важной средой для хранения углеводов в организме и содержится в цитозольных гранулах.
• Общее хранение гликогена: ∼ 400–450 г (обеспечивает глюкозу на 12–48 часов)
• Химическая структура
  • Разветвленный полимер, состоящий из нескольких связанных цепей глюкозы
  • Разветвления: α-1,6-гликозидные связи
  • Связи: α-1,4-гликозидные связи

Периодическая кислота – окраска Шиффа — это иммуногистохимический метод, используемый для визуализации полисахаридов, таких как гликоген.

Гликогенез

2.) Начальное формирование цепи

• Гликогенин
  • Фермент, состоящий из гомодимерного белка, который находится в ядре каждой единицы гликогена и является отправной точкой синтеза гликогена.
  • Катализирует образование коротких цепей гликогена путем полимеризации нескольких молекул UDP-глюкозы

3.) Удлинение цепи

Ферментом, определяющим скорость гликогенеза, является гликогенсинтаза.

4.) Разветвление цепей гликогена

• Фермент разветвления: фермент с активностью глюкозилтрансферазы, который вводит разветвления в цепь гликогена, чтобы обеспечить дальнейшее удлинение цепи во многих участках комплекса гликогена
  • Катализирует образование α-1,6-гликозидных связей: гидролизует цепь из 6 единиц глюкозы от исходной цепи → присоединение молекул к атому C6 другой единицы глюкозы в исходной цепи
  • Ветви вводятся не менее чем на 4 единицы глюкозы друг от друга.

Последовательность синтеза гликогена, начиная с глюкозы: Glc → Glc-6-P → Glc-1-P → UDP-Glc → гликоген

Гликогенолиз

1.) Высвобождение глюкозы

• Расщепление α-1,4-гликозидных связей: гликогенфосфорилаза (кофактор витамина B6) отщепляет глюкозу-1-P; через фосфорную реакцию до тех пор, пока на ответвлении не останется 4 концевых остатка глюкозы (так называемый предельный декстрин).
• Разрыв α-1,6-гликозидных связей
  • Ферменты разветвления: фермент, обладающий глюкозилтрансферазной, а также глюкозидазной активностью
    • Первый шаг: гликозилтрансфераза; (или 4-α-D-глюканотрансфераза): переносит 3 из 4 оставшихся остатков глюкозы ветви в соседнюю ветвь
    • Второй этап: глюкозидаза (или амило-α-1,6-глюкозидаза): отщепляет оставшееся звено глюкозы (связь альфа-1,6) от ветви; через гидролитическую реакцию → высвобождение нефосфорилированных свободных молекул глюкозы и линейной цепи гликогена

Часть гликогена не разлагается гликогенфосфорилазой и ферментами разветвления, а в лизосомах — лизосомальной альфа-глюкозидазой.Дефицит этого фермента приводит к болезни Помпе (болезнь накопления гликогена II).

Болезнь Кори — это тип нарушения накопления гликогена (тип III), вызванный дефицитом фермента, расщепляющего ответвления гликогена (α-1,6-глюкозидазы).

Болезнь Макардла — болезнь накопления гликогена, характеризующаяся дефицитом гликогенфосфорилазы в скелетных мышцах.

2) Утилизация глюкозы

После гликогенолиза фосфоглюкомутаза (изомераза) превращает глюкозу-1-P в глюкозу-6-P

• В мышцах
  • Мгновенный метаболизм глюкозы-6-P во время упражнений (гликолиз)
  • Гексокиназа: превращает свободную глюкозу в глюкозу-6-P
• В печени: глюкозо-6-фосфатаза: глюкоза-6-P → свободная глюкоза → высвобождение в системный кровоток → повышение уровня глюкозы в сыворотке.

Ферментом, определяющим скорость гликогенолиза, является гликогенфосфорилаза.

Болезни накопления гликогена вызываются наследственной недостаточностью ферментов гликогенолиза, что приводит к накоплению нормального или патологически структурированного гликогена в клетках скелетных мышц и печени, основных запасах гликогена в организме.

Постановление

Повышенное содержание фосфата в клетках является сигналом голодания: все ферменты, которые повышают уровень сахара в крови, активны в их фосфорилированной форме!

Гормональная регуляция

Инсулин стимулирует накопление липидов, белков и гликогена.

Гликогенсинтаза стимулируется глюкозо-6-фосфатом, инсулином и кортизолом. Он ингибируется адреналином и глюкагоном.

Аллостерическая / негормональная регуляция

• Сокращение мышц увеличивает уровень внутриклеточного кальция → ↑ кальмодулин

Эти регуляторные процессы происходят только в скелетных мышцах, но не в печени.

Клиническое значение

гликоген

Гликоген представляет собой полисахарид глюкозы (Glc), который функционирует как первичный краткосрочный накопитель энергии в клетках животных.Он вырабатывается в основном печенью и мышцами, но также может вырабатываться мозгом, маткой и влагалищем. ^[1] Гликоген является аналогом крахмала, менее разветвленного полимера глюкозы в растениях, и обычно обозначается как животный крахмал , имеющий структуру, аналогичную амилопектину. Гликоген находится в форме гранул в цитозоле во многих типах клеток и играет важную роль в цикле глюкозы. Гликоген образует запас энергии, который можно быстро мобилизовать для удовлетворения внезапной потребности в глюкозе, но он менее компактный, чем запасы энергии триглицеридов (жира).В гепатоцитах печени гликоген может составлять до 8% от сырого веса (100–120 г у взрослого человека) вскоре после еды. ^{[ необходима ссылка ]} Только гликоген, хранящийся в печени, может быть доступен другим органам. В мышцах гликоген содержится в гораздо более низкой концентрации (1% от мышечной массы), но общее количество превышает таковое в печени. Небольшие количества гликогена обнаруживаются в почках, а еще меньшие количества — в некоторых глиальных клетках головного мозга и лейкоцитах.Во время беременности матка также накапливает гликоген для питания эмбриона.

Рекомендуемые дополнительные знания

Строение и биохимия

Гликоген — это сильно разветвленный полимер, который лучше описать как дендример, состоящий примерно из 60 000 остатков глюкозы и имеющий молекулярную массу от 10 ⁶ до 10 ⁷ дальтон (~ 4.8 миллионов). ^{[необходима ссылка ]} Большинство единиц Glc связаны α-1,4-гликозидными связями, примерно 1 из 12 остатков Glc также образует гликозидную связь -1,6 со вторым Glc, что приводит к образованию ответвления. . Гликоген не имеет восстанавливающего конца: остаток глюкозы «восстанавливающий конец» не является свободным, но ковалентно связан с белком, называемым гликогенином, как бета-связь с поверхностным остатком тирозина. Гликогенин представляет собой гликозилтрансферазу и находится в виде димера в ядре гликогена.Гранулы гликогена содержат как гликоген, так и ферменты синтеза гликогена (гликогенез) и деградации (гликогенолиз). Ферменты вложены между внешними ветвями молекул гликогена и действуют на невосстанавливающие концы. Следовательно, множество невосстанавливающих концевых ответвлений гликогена способствуют его быстрому синтезу и катаболизму.

Функция и регуляция гликогена печени

Когда углеводная пища съедается и переваривается, уровень глюкозы в крови повышается, а поджелудочная железа выделяет инсулин.Глюкоза из воротной вены попадает в клетки печени (гепатоциты). Инсулин воздействует на гепатоциты, стимулируя действие нескольких ферментов, включая гликогенсинтазу. Молекулы глюкозы добавляются к цепочкам гликогена до тех пор, пока инсулин и глюкоза остаются в изобилии. В этом постпрандиальном или «сытом» состоянии печень забирает из крови больше глюкозы, чем выделяет.

После того, как еда переварена и уровень глюкозы начинает падать, секреция инсулина снижается, и синтез гликогена прекращается.Примерно через четыре часа после еды ^{[ цитирование необходимо ]} , гликоген начинает расщепляться, чтобы снова превратиться в глюкозу. Гликогенфосфорилаза — это основной фермент расщепления гликогена. В течение следующих 8–12 часов глюкоза, полученная из гликогена печени, будет основным источником глюкозы в крови, который будет использоваться остальными частями тела в качестве топлива.

Глюкагон — еще один гормон, вырабатываемый поджелудочной железой, который во многих отношениях служит контрсигналом для инсулина. Когда уровень сахара в крови начинает падать ниже нормы, глюкагон секретируется в увеличивающихся количествах.Он стимулирует расщепление гликогена на глюкозу даже при аномально высоком уровне инсулина.

В мышечных и других клетках

Гликоген мышечных клеток действует как непосредственный резервный источник доступной глюкозы для мышечных клеток. Другие ячейки, содержащие небольшие количества, также используют его локально. Мышечные клетки не способны передавать глюкозу в кровь, поэтому гликоген, который они хранят внутри, предназначен для внутреннего использования и не передается другим клеткам, в отличие от клеток печени.

Долг гликогена и упражнения на выносливость

Из-за неспособности организма удерживать более 2000 ккал гликогена, ^{[ цитирование необходимо ]} спортсменов на длинные дистанции, таких как марафонцы, лыжники и велосипедисты, попадают в долги гликогена, при этом почти все Запасы гликогена у спортсмена истощаются после длительных периодов нагрузки без достаточного потребления энергии. Это явление называется «удар о стену» или «удары». У марафонцев это обычно происходит примерно на отметке 20 миль (32 км) марафона, где на милю расходуется около 100 ккал, ^{[ цитата требуется ]} в зависимости от размера бегуна и дистанции бега.Однако это может быть отложено из-за углеводной загрузки перед задачей.

Испытывая дефицит гликогена, спортсмены часто испытывают сильную усталость до такой степени, что им становится трудно двигаться.

Нарушения обмена гликогена

Наиболее частым заболеванием, при котором метаболизм гликогена становится ненормальным, является диабет, при котором из-за ненормального количества инсулина гликоген в печени может накапливаться или истощаться. Восстановление нормального метаболизма глюкозы обычно также нормализует метаболизм гликогена.

При гипогликемии, вызванной чрезмерным количеством инсулина, уровни гликогена в печени высоки, но высокий уровень инсулина препятствует гликогенолизу, необходимому для поддержания нормального уровня сахара в крови. Глюкагон — распространенное средство для лечения этого типа гипогликемии.

Различные врожденные нарушения метаболизма вызваны недостатком ферментов, необходимых для синтеза или распада гликогена. В совокупности они называются болезнями накопления гликогена.

Синтез

Основная статья: Гликогенез

Синтез гликогена отличается от распада гликогена.В отличие от распада, синтез является эндергоническим, что означает, что гликоген не синтезируется без ввода энергии. Энергия для синтеза гликогена поступает от UTP, который реагирует с глюкозо-1-фосфатом, образуя UDP-глюкозу, в реакции, катализируемой UDP-глюкозедифосфорилазой. Гликоген синтезируется из мономеров UDP-глюкозы ферментом гликоген-синтазой, который постепенно удлиняет цепь гликогена. Поскольку гликогенсинтаза может только удлинить существующую цепь, белок гликогенин необходим для инициации синтеза гликогена.

Разбивка

Основная статья: Гликогенолиз

Гликоген отщепляется от невосстанавливающих концов цепи ферментом гликогенфосфорилазой с образованием мономеров глюкозо-1-фосфата, который затем превращается в глюкозо-6-фосфат. Для удаления альфа (1-6) разветвлений разветвленного гликогена и преобразования цепи в линейный полимер необходим специальный фермент разветвления. Произведенные мономеры G6P имеют три возможных судьбы:

• G6P может продолжать путь гликолиза и использоваться в качестве топлива. Анатомия и физиология. Саладин, Кеннет С. Макгроу-Хилл, 2007.

См. Также

Болезнь накопления гликогена, тип III: MedlinePlus Genetics

Болезнь накопления гликогена, тип III (также известная как GSDIII или болезнь Кори) — это наследственное заболевание, вызываемое накоплением сложного сахара, называемого гликогеном, в клетках организма. Накопленный гликоген является структурно ненормальным и нарушает функцию определенных органов и тканей, особенно печени и мышц.

GSDIII делится на типы IIIa, IIIb, IIIc и IIId, которые различаются по типу признаков и симптомов. GSD типов IIIa и IIIc в основном поражают печень и мышцы, а GSD типов IIIb и IIId обычно поражают только печень. Очень трудно различить типы GSDIII, которые влияют на одни и те же ткани. GSD типов IIIa и IIIb являются наиболее частыми формами этого состояния.

Начиная с младенчества, люди с любым типом GSDIII могут иметь низкий уровень сахара в крови (гипогликемию), избыточное количество жиров в крови (гиперлипидемия) и повышенный уровень ферментов печени в крови.По мере взросления у детей с этим заболеванием обычно увеличивается печень (гепатомегалия). Размер печени обычно возвращается к норме в подростковом возрасте, но у некоторых больных в более позднем возрасте развивается хроническое заболевание печени (цирроз) и печеночная недостаточность. Люди с GSDIII часто имеют медленный рост из-за проблем с печенью, что может привести к низкому росту. У небольшого процента людей с GSDIII в печени могут образовываться доброкачественные опухоли, называемые аденомами.

У людей с GSDIIIa в более позднем возрасте может развиться мышечная слабость (миопатия).Эти мышечные проблемы могут влиять как на сердечную (сердечную) мышцу, так и на мышцы, которые используются для движения (скелетные мышцы).