Цистеин аминокислота: Цистеин | Атлас аминокислот

Содержание

Цистеин | Атлас аминокислот

Цистеин — это стандартная аминокислота, необходимая людям для нормального функционирования. Она особенна тем, что содержит в своём составе функциональную тиольную (—SH) группу.

Основные сведения
Однобуквенный код	C
Трёхбуквенный код	Cys
Название по IUPAC	(2R)-2-амино-3-сульфанилпропановая кислота
Химическая формула	HO2CCH(Nh3)Ch3SH
Брутто-формула	C3H7NO2S
Идентификатор PubChem	5862
Физико-химические свойства
Молярная масса	121,16 г/моль
pK1	1.96
pK2	10.28
pKR	8.18
pI	5.07
Гидропатический индекс	2.5
Общее
Встречаемость в белках	1.9%
Заменимость	заменимая

—SH-Группа особенна тем, что является хорошим нуклеофилом, поэтому может вступать в реакции нуклеофильного присоединения или замещения. Остатки цистеина в белках имеют константу диссоциации pK_a, близкую к нейтральной, поэтому часто они находятся в форме тиолат-иона: именно в такой форме цистеин наиболее реакционно активен.

Существует ряд ферментов, принцип действия которых основан на нуклеофильной атаке цистеина. К ним относится, например, убиквитинлигаза, которая ковалентно присоединяет убиквитин (прим.: Убиквитин — это небольшой регуляторный белок, выполняющий ряд важных функций в клетках эукариот.) к белку-мишени изопептидной связью. Также нуклеофилами благодаря цистеину являются белки-каспазы (cysteine-dependent aspartate specific protease), которые играют важную роль в процессах апоптоза, некроптоза и проч.

Структурно цистеин очень похож на серин, однако, в отличие от серина, цистеин склонен участвовать в окислительно- восстановительных реакциях: так, окисление цистеина приводит к возникновению связи между двумя атомами серы из двух разных остатков этой аминокислоты.

Такие ковалентные связи между двумя атомами серы часто назыают «дисульфидными мостиками». Они играют важную роль при фолдинге белков и поддержинии их устойчивости. Например, в белках, которые выделяются во внеклеточную среду, число SS-мостиков избыточно, чтобы увеличить стабильность молекулы в суровых условиях, а также усилить протеолитическую сопротивляемость. В белках же, которые используются внутри клетки, дисульфидные мостики играют роль в поддержании третичной структуры белка. Так, в инсулине две отдельные полипептидные цепи «сшиты» парой дисульфидных связей.

Цистеин может проявлять себя в различных ДНК-белковых взаимодействиях, входя в состав различных белковых структур, таких как, например, цинковые пальцы. Цинковый палец — небольшой белковый мотив, стабилизированный одним или двумя ионами цинка, связанными координационными связями с аминокислотными остатками белка. Как правило, цинковый палец включает около 20 аминокислот, а сам ион цинка связывает 2 гистидина и 2 цистеина. Цинковые пальцы являются белковыми модулями, взаимодействующими с ДНК, РНК, другими белками или небольшими молекулами. Основными группами белков с цинковыми пальцами являются ДНК-связывающие факторы транскрипции, а также искусственные ферменты рестрикции, получаемые слиянием ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом. Домен цинкового пальца может быть спроектирован так, чтобы узнавать желаемую последовательность ДНК и связываться с ней.

Важную роль цистеин играет в молекуле рецептора витамина D. Молекула РВД состоит из трех функциональных доменов. Первый из них, С1, — гидрофильный домен, эволюционно наиболее консервативен и имеет большое сходство с ядерными рецепторами. Он расположенный на N-конце РВД, содержит 70 аминокислот и богат цистеином, лизином и аргинином. В функционально активной молекуле РВД первые 8 цистеинов связаны с двумя атомами цинка и образуют структуру цинковых пальцев, которая, взаимодействуя с ДНК, может регулировать работу многих генов мишеней. Мутации, приводящие к замене любого из этих цистеинов, блокируют связывание РВД со специфической последовательностью ДНК, прерывая, таким образом, РВД-зависимую активацию генов-мишеней. Известно, что такие мутации чаще всего несовместимы с жизнью или могут приводить к редкому моногенному заболеванию — витамин-D-резистентному рахиту.

Источники

Википедия: Цистеин

New World Encyclopedia: Cysteine
Генетический паспорт — осонова индивидуальной и предиктивной медицины. /Под редакцией В. С. Баранова. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2009.-528 c.:ил.
Википедия: Цинковый палец

Цистеин — заменимая аминокислота

Цистеин достаточно широко применяется в качестве спортивной добавки и медицинского средства для восстановления баланса аминокислот, улучшения физического состояния, усиления процессов регенерации и детоксикации.

Что такое цистеин?

Цистеин – это алифатическая аминокислота, одна из двадцати, участвующих в синтезе большинства белков, особенно белков кожи (коллаген) и волос (кератин). Считается частично заменимой, т.к. может вырабатываться в организме из серина и метионина, но синтез собственного цистеина не покрывает всех потребностей организма, особенно при интенсивном расходе этой аминокислоты при активной физической работе или спортивных тренировках. Тем не менее, благодаря поступлению в организм цистеина из пищи, его дефицит возникает редко.

Формула цистеина

Формула цистеина интересна тем, что в нее входит сера, играющая важнейшую роль во многих обменных процессах. Благодаря этому цистеин входит в состав множества ферментов. Кроме того, серосодержащая тиольная группа в молекуле цистеина активно участвует в связывании и выведении тяжелых металлов (ртуть, кадмий, свинец).

Одна из главных функций цистеина (кроме участия в синтезе белков) – выступать в качестве антиоксиданта, образуя (вместе с глицином и глютаминовой кислотой) важнейшее соединение глютатион. Глютатион защищает клетку от повреждения активными формами кислорода, а также обеспечивает нормальный баланс окислительно-восстановительных реакций. Кроме того, глютатион играет ключевую роль в выведении ряда токсичных веществ, образующихся в печени.

Чем полезен цистеин?

В синтезе белка участвует только L-цистеин, на это необходимо обращать внимание, приобретая добавки и препараты с этой аминокислотой. Поэтому цистеин важен при спортивных занятиях – он помогает не только наращивать мышечную массу, но и поддерживать здоровье суставов, кожи и других органов, более активно сжигать жировые отложения.

Цистеин требуется для выработки таурина, играющего важную роль в регенерационных процессах. Такое свойство цистеина используется при лечении глазных болезней (например, катаракты на ранних стадиях).

Аминокислота цистеин обладает способностью разжижать слизь, и в частности, проявляет отхаркивающее действие, благодаря чему (предположительно) включается в состав сигаретных добавок. В форме ацетилцистеина широко применяется в медицине как муколитическое средство. Его применение помогает не только более активно выводить слизь, но подавляет воспаление в легочных тканях, усиливает активность лейкоцитов и лимфоцитов.

Еще одна важная и весьма полезная особенность цистеина состоит в его способности снижать токсическое действие алкоголя. Цистеин активизирует переработку ядовитого ацетальдегида (метаболита этанола, ответственного за самые явные токсические эффекты похмелья) в уксусную кислоту.

Кроме того, исследования выявили влияние цистеина на сопротивляемость радиации. Введение этой аминокислоты крысам за 10 мин до облучения заметно повысило их выживаемость.

В каких продуктах много цистеина?

Наибольшее количество кислоты цистеина содержится в белке куриного яйца (2100 мг на 100 г). Кроме того, им богаты:

соевый протеин (700-1000 мг),
конопляное семя, соя и спирулина (700 мг),
овсяные отруби (600 мг),
свиные и говяжьи субпродукты (печень, почки, сердце) – от 400 до 600 мг,
икра, овсяные хлопья и семечки подсолнечника (500 мг).

Для хорошего усвоения цистеина из продуктов необходимо также достаточное количество витаминов группы B (особенно B6), C и E, а также селена и кальция.

Добавки цистеина

Л-цистеин можно принимать в форме добавки, особенно когда его не хватает в пищевых продуктах. Нормальной для спорта считается дозировка от 1000 до 2000 мг в сутки. Превышать дозировку в 5000 мг настоятельно не рекомендуется из-за возможного вреда для здоровья. Противопоказанием к приему цистеина являются аллергические реакции. С осторожностью следует принимать добавку при серьезных заболеваниях ЖКТ и печени, а также при сахарном диабете.

L-цистеин — «Гиорд»

Цистеин — заменимая аминокислота, существующая в виде двух соединений: L- и D-изомеров. L-цистеин применяется для создания добавки Е920, которая относится к группе антифламингов — веществ, улучшающих муку и качество готовых продуктов.

Получение и свойства

Пищевая добавка Е920 производится путем гидролиза кератинсодержащих животных продуктов кислотными растворами. L-цистеин также получают методом микробиологической ферментации, но стоимость производства в этом случае возрастает.

По внешнему виду данная пищевая добавка представляет собой водорастворимый кристаллический порошок с нерезким специфическим запахом.

Достигаемые эффекты:

ускорение времени подъема теста;
улучшение его реологических свойств;
повышение эластичности мякиша;
предупреждение возникновения пустот в хлебе;
ускорение окрашивания колбас и сосисок;
сохранение цвета продукции при термической обработке.

Особенно актуально использование добавки при изготовлении изделий из муки со слабой или слишком крепкой клейковиной. L-цистеин используется в производстве мясопродуктов совместно с пищевыми красителями, усиливает аромат продукции. В спортивном питании добавка Е920 выполняет роль ускорителя сжигания жиров и способствует формированию белка коллагена.

Комплексные пищевые добавки могут включать в себя, помимо L-цистеина, различные эмульгаторы, ферменты, стабилизаторы, которые в совокупности обеспечивают еще больший положительный эффект.

На рынке можно встретить хлебопекарные улучшители с L-цистеином производства разных компаний, в том числе инновационную разработку от «ГИОРД» — СТАБИЛАН ФЛАУ Н1 (арт. 250521).

Вопросы безопасности

При правильном применении L-цистеин безвреден для потребления, так как аминокислота сама по себе может синтезироваться в организме. Поступая извне, добавка легко усваивается. В сочетании с аскорбиновой кислотой вещество приобретает мощные антиоксидантные свойства. При нагревании L-цистеин превращается в цистин. Добавка окисляется при доступе воздуха, поэтому продукт хранят в тщательно упакованном виде с защитой от воздействия внешних факторов.

Добавка противопоказана людям, страдающей цистинурией (редкое наследственное заболевание, при котором образуются цистиновые камни). В целом L-цистеин благотворно влияет на здоровье человека, поэтому улучшитель получил одобрение на использование в пищевой индустрии в России и за рубежом.

Цистеин — инструкция по применению

Цистеин (α-амино-β-тиопропионовая кислота; 2-амино-3-меркаптопропановая кислота) — алифатическая серосодержащая аминокислота. Оптически активна, существует в виде L- и D- изомеров. L-Цистеин входит в состав белков и пептидов, играет важную роль в процессах формирования тканей кожи. Имеет значение для дезинтоксикационных процессов.

Содержание в организме

Цистеин входит в состав α-кератинов, основного белка ногтей, кожи и волос. Он способствует формированию коллагена и улучшает эластичность и текстуру кожи. Цистеин входит в состав и других белков организма, в том числе некоторых пищеварительных ферментов.

Биологические функции

Цистеин — заменимая аминокислота. Он может синтезироваться в организме млекопитающих из серина с участием метионина как источника серы, а также АТФ и витамина B₆. В некоторых микроорганизмах источником серы для синтеза цистеина может быть сероводород. Цистеин способствует пищеварению, участвуя в процессах переаминирования. Способствует обезвреживанию некоторых токсических веществ и защищает организм от повреждающего действия радиации. Один из самых мощных антиоксидантов, при этом его антиоксидантное действие усиливается при одновременном приёме витамина C и селена. Цистеин является предшественником глутатиона — вещества, оказывающего защитное действие на клетки печени и головного мозга от повреждения алкоголем, некоторыми лекарственными препаратами и токсическими веществами, содержащимися в сигаретном дыме.

Содержание в продуктах питания

Содержится в продуктах питания с высоким уровнем белка.

Также некоторое количество цистеина содержится в красном перце, чесноке, луке, брюссельской капусте, брокколи.

Получение

Основной метод получения L-цистеина в промышленности — гидролиз белковых кератинсодержащих отходов с высоким содержанием цистеина — птичьих перьев, щетины, человеческого волоса; гидролиз проводится 20%-й соляной кислотой. Выход цистеина из волос составляет до 100 кг на тонну сырья.

Рацемический цистеин может быть получен стандартными методами синтеза — например, алкилированием фталимидомалонового эфира хлорметил(бензил)сульфидом с дальнейшим гидролизом продукта алкилирования до S-бензилцистеина и его восстановлением в цистеин.

Применение

Цистеин растворяется лучше, чем цистин, и быстрее утилизируется в организме, поэтому его чаще используют в комплексном лечении различных заболеваний.

Дополнительный приём цистеина необходим при ревматоидном артрите, заболеваниях артерий, раке. Он ускоряет выздоровление после операций, ожогов, связывает тяжёлые металлы и растворимое железо. Эта аминокислота также ускоряет сжигание жиров и образование мышечной ткани. L-цистеин обладает способностью разрушать слизь в дыхательных путях, благодаря этому его часто применяют при бронхитах и эмфиземе лёгких. Он ускоряет процессы выздоровления при заболеваниях органов дыхания и играет важную роль в активизации лейкоцитов и лимфоцитов.

При цистинурии, редком генетическом состоянии, приводящем к образованию цистиновых камней, принимать цистеин нельзя. Сахарный диабет также является противопоказанием для назначения цистеина.

L-цистеин зарегистрирован в качестве пищевой добавки E920 (L-цистин — E921).

Объявления о защитах диссертаций,Диссертационный совет

08.09.2021

Косова Нина Васильевна Диссертация «Механохимически стимулированный синтез наноструктурированных катодных материалов для металл-ионных аккумуляторов » на соискание ученой степени доктора химических наук

Защита диссертации: 22.12.2021

26.07.2021

Шиндров Александр Александрович Диссертация «Смешанно-анионные железо-натрийсодержащие соединения как матрицы для обратимой интеркаляции ионов щелочных металлов» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 06.10.2021

21.09.2020

Масленников Даниэль Владимирович Диссертация «Исследование факторов, определяющих морфологию и микроструктуру продуктов реакции термического разложения (Ce_1-xGd_x)₂ (C₂O₄)₃•10H₂O (x = 0, 0.1)» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 02.12.2020

08.06.2020

Бычков Алексей Леонидович Диссертация «Механохимическая обработка природных полимеров и её технологическое применение» на соискание ученой степени доктора химических наук

Защита диссертации: 23.09.2020

08.06.2020

Мищенко Ксения Владимировна Диссертация «Синтез и термические превращения формиатов и оксокарбоната висмута с получением металлического висмута и его оксидов» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 16.09.2020

04.10.2019

Ухина Арина Викторовна Диссертация «Структурно-морфологические особенности формирования металл-алмазных композиций» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 18.12.2019

19.08.2019

Семыкина Дарья Олеговна Диссертация «Cтруктурно-морфологические и электрохимические свойства натрий/литий ванадий-содержащих электродных материалов для натрий/литий-ионных аккумуляторов» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 27.11.2019

15.10.2018

Тяпкин Павел Юрьевич Диссертация «Нанокомпозиты на основе оксидов железа, синтезированных в порах мезопористого диоксида кремния» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 21.12.2018

08.10.2018

Скрипкина Татьяна Сергеевна Диссертация «Механохимическая модификация структуры гуминовых кислот для получения комплексных сорбентов» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 19.12.2018 в 10:00

08.10.2018

Подгорбунских Екатерина Михайловна Диссертация «Исследование механоферментативных превращений полимеров трудноперерабатываемого растительного сырья» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 19.12.2018 в 12:00

03.10.2018

Шубникова Елена Викторовна Диссертация «Структура и кислородная проницаемость оксидов со смешанной проводимостью
Sr_1-yBa_yCo_0.8-xFe_0.2M_xO_3-δ (M=W, Mо)» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 05.12.2018

26.09.2018

Лозанов Виктор Васильевич Диссертация «Синтез и физико-химическое исследование тугоплавких соединений, образующихся в системах на основе гафния, тантала и иридия» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 12.12.2018

03.05.2017

Прокип Владислав Эдвардович Диссертация «Физико-химическое исследование германатов гафния» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 05.07.2017 в 10:00

01.02.2017

Пестерева Наталья Николаевна Диссертация «Процессы переноса вдоль границы раздела фаз MeWO₄|WO₃ и физико-химические свойства композитов MeWO₄-WO₃ (Me = Ca, Sr, Ba)» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 05.04.2017 в 10:00

27.12.2016

Попов Михаил Петрович Диссертация «Изучение влияния модификации вольфрамом на функциональные свойства перовскита состава Ba_0.5Sr_0.5Co_0.8Fe_0.2O_3-δ» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 01.03.2017 в 10:00

10.08.2016

Подгорнова Ольга Андреевна Диссертация «Синтез, структура и электрохимические свойства катодных материалов на основе LiCoPO₄» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 12.10.2016 в 10:00

22.04.2016

Рыбин Вячеслав Андреевич Диссертация «Физико-химическое исследование базальтового волокна с защитными щелочестойкими покрытиями» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 22.06.2016 в 10:00

23.10.2015

Архипов Сергей Григорьевич Диссертация «Получение сокристаллов и солей аминокислот с органическими кислотами и сравнение их структуры и свойств со структурами и свойствами исходных компонентов» на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Защита диссертации: 24.12.2015 в 10:00

ЦИСТЕИН — это… Что такое ЦИСТЕИН?

Цистеин — Цистеин … Википедия

ЦИСТЕИН — (HSCh3Ch3COOH), кристаллическая аминокислота, содержащаяся в животных белках, особенно в составе волос, копыт и кератина в коже. Благодаря наличию групп HS это вещество служит катализатором для некоторых энзимов … Научно-технический энциклопедический словарь

ЦИСТЕИН — L ? амино ? тиопропионовая к та, заменимая серусо держащая аминокислота. Входит в состав почти всех природных белков и глутатио на. Занимает центр, место в обмене серусодержащих соединений. Выполняет защитную функцию, связывая токсичные ионы… … Биологический энциклопедический словарь

цистеин — сущ., кол во синонимов: 2 • аминокислота (36) • антиоксидант (26) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

цистеин — Серосодержащая аминокислота [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN cysteine … Справочник технического переводчика

цистеин — h3NCH(Ch3SH)COOH, алифатическая аминокислота. Входит в состав белков, глутатиона. Сульфгидрильные ( SH) группы цистеина важны для проявления биологической активности многих ферментов, белковых гормонов, токсинов. В организме легко превращается в… … Энциклопедический словарь

цистеин — cisteinas statusas T sritis chemija formulė HSCH₂CH(NH₂)COOH santrumpa( os) Cys, C atitikmenys: angl. cysteine rus. цистеин ryšiai: sinonimas – 2 amino 3 merkaptopropano rūgštis … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas

цистеин — заменимая в питании человека моноаминомонокарбоновая, содержащая сульфгидрильные группы аминокислота, входящая в состав всех белков и глутатиона; в организме недоношенных детей биосинтез Ц. недостаточен … Большой медицинский словарь

Цистеин — α амино β тиопропионовая кислота, HSCh3CH (Nh3) COOH; серусодержащая аминокислота. Существует в виде двух оптически активных L и D форм и рацемической DL формы. L Ц. входит в состав почти всех природных белков и Глутатиона. При гидролизе… … Большая советская энциклопедия

ЦИСТЕИН — (2 амино З меркаптопропионовая к та, меркаптоаланин, Cys, С) HSCh3CH(Nh3)COOH, мол. м. 121,16. L Ц. бесцв. кристаллы, т. пл. гидрохлорида 178 … Химическая энциклопедия

Л-Цистеин | L-Cysteine

Расширенный поиск

Название:

Артикул:

Текст:

Выберите категорию:

Производитель:

Все1Kvit-C21st Century23 Co.25 час2SN4th & HeartA VogelA.C. Grace CompanyAbkitAbsolute NutritionAction LabsActivLabAdvance Physician Formulas, Inc.Advanced ClinicalsAdvanced Orthomolecular Research AORAerobic LifeAgeless Foundation LaboratoriesAI Sports NutritionAirBorneAlba BotanicaAlgalifeAll American EFXAll NutritionAll One, NutritechAllergy Research GroupALLMAX NutritionAllViaAlmased USAAloha Medicinals Inc.Alphex biochemical Corp.Alta HealthAmazing GrassAmazing HerbsAmazon TherapeuticsAmerican BiosciencesAmerican Biotech LabsAmerican HealthAminoXLAnabolic Science Labs (ASL)Ancient ApothecaryAncient NutritionAndalou NaturalsAnnie’s NaturalsAnonymous LabANSAOLIKESappliednutritionAPS NutritionArizona NaturalArm & HammerArmakonlabsArnoldArrowhead MillsArthur Andrew MedicalArtisanaArtnaturalsAscentaAshitaba Sprouts PowderASLASL (Anabolic Scince Labs)Aspire Sports NutritionAST Sports ScienceAsutraAtkinsAubrey OrganicsAuromereAurora NutrascienceAXXCELERATED SPORTS NUTRITIONAyush Herbs Inc.AzeliqueAzoBachBadger CompanyBalance BarBalanceuticalsBarlean’sBarney ButterBausch & LombBaywoodBe FirstBears PowerBellybarBenfotiamine Inc.BentonBergin Fruit and Nut CompanyBeyond FreshBio NutritionBio Tech NutraBio Tech Pharmacal, IncBioAdvantex PharmaBiochemBioGaiaBioglanBionaturaeBiopharmBiopharmaBioray Inc.BioSchwartzBioSil by Natural FactorsBioTech USABiotiviaBioVeaBlack MagicBlack MonsterBlackstone LabsBlender BottleBlistexBlitheBlue PeptidesBluebonnet NutritionBNRGBob’s Red MillBody FortressBody StrongBodylogixBoironBoiron, Single RemediesBOMBBARBona DietBPI SportsBrainStrongBrobolicsBSNBucked UpBuried TreasureBusta CapC.C. PollenCajuBrasilCalifornia Gold Nutrition, CGNCalifornia Olive RanchCanada PeptidesCardiovascular Research Ltd.Caribbean SolutionsCarlson LabsCarrington FarmsCartel LabsCascadian FarmCellucorCeltic Sea SaltCenturion LabzChaos and PainChaotic LabzChemix LifestyleChibaChikalabChildLifeChristopher’s Original FormulasCitracalCLEAN MACHINEClif BarClomaPharma LaboratoriesCM TechCobra LabsCococareCoconut SecretColman’sColorKitchenComics LabsComvitaCONDEMNED LABCondemned LaboratoriezControlled LabsCORAL LLCCore Labs XCORE LABS X / REVANGE NUTRITIONCoromegaCosmedica SkincareCountry FarmsCountry LifeCreative BioscienceCrunch BrunchCrystal StarCTD SportsCulturelleCybermassCytosportCytosport, IncDagoba Organic ChocolateDaily Wellness CompanyDark MetalDark PharmDastonyDavidson’s TeaDaVinci Laboratories of VermontDdropsDerma EdeSIAMDesigner ProteinDetourDevaDiamond Herpanacine AssociatesDivine HealthDoctor’s BestDr. Axe / Ancient NutritionDr. MercolaDr. Murray’sDr. Ohhira’s, Essential Formulas Inc.Dr.HoffmanDragon Herbs ( Ron Teeguarden )Dragon Pharma LabsDream WaterDRT SupplementsDukan DietDymatize NutritionDYNAMIC EVOLUTIONDynamic HealthE.L.F. CosmeticsEarnest EatsEarth Circle OrganicsEarth’s Bounty ( Matrix Health )EarthriseEarthtone FoodsEat the BearEclectic InstituteEconugenicsEden FoodsEdward & SonsEFX SportsEidon Mineral SupplementsELEMENTICA | organicElevationEmerald Health Bioceuticals, IncEmerald LaboratoriesEmergen-CEmeritaEmu GoldENADAENDORPHINEner-CEnjoy Life FoodsEnvenom PharmEnzymatic TherapyEnzymedicaEpic BarEpic DentalEpic LabsEPIQEqual ExchangeEstrovenEuropean Gourmet BakeryEuroPharmaEuroPharma, Terry NaturallyEvergameEveryday MineralsEVLution NutritionExploding BudsFairhaven HealthFEMMEFinaflexFireBox NutritionFit & FreshFit & LeanFit KitFIT-RxFITCRUNCHFitMissFitness AuthorityFitRuleFlapJackedFlintstonesFloraFlower Essence ServicesFOLIGAINFoods AliveFoodScienceFormutech NutritionFour SigmaticFreak LabelFREEDOM FORMULATIONS / RISE /Frog TechFrontier Natural ProductsFun Fresh FoodsFungi PerfectiFurther FoodFutureBioticsGaeaGaia HerbsGaia Herbs Professional SolutionsGarden GreensGarden of LifeGASPGaspari NutritionGATGECGenceutic NaturalsGenerix LaboratoriesGeneticLabGenexa LLCGenoneGenoPharmGenuine Health CorporationGeonlabGifted AthleticsGo RawGold StarGold’s GymGolden FlowerGoStakGreen Foods CorporationGreenPeachGreens FirstGreens PlusGrenadeGroceryGrowing NaturalsGummi KingGummiologyGummYum!HairfinityHana BeverageHarmonic InnerprizesHealth and Wisdom Inc.Health DirectHealth From The SunHealth PlusHealth Warrior, Inc.HealthForce SuperfoodsHealthSmart Foods, Inc.Healthy OriginsHell_labsHerb PharmHerbal Answers, IncHerbs Etc.Heritage StoreHero Nutritional ProductsHi Tech PharmaceuticalsHimalaniaHimalayaHimalaya Herbal HealthcareHistorical RemediesHobe LabsHollywood DietHomeHome HealthHoney GardensHot KidHouston EnzymesHumanNHumatropeHyalogic LLCHydralyteHydroxycutHyland’sHyperbioticsiForce NutritioniHerb GoodsIHS technologyIlhwaImperial ElixirIndiumeaseInfinite labsInnate Response FormulasInnovative Diet labsInnovative LaboratoriesInnovative LabsInnovixLabsInsane labzInstaNaturalIntel PharmaIntensive NutritionInterPlexus Inc.Invitro LabsIP-6 InternationalIron AddictsIronmanIronTrueIrwin NaturalsJan TanaJarrow FormulasJason NaturalJNX SportsJulian BakeryJust Hemp FoodsKaged MuscleKALKare n HerbsKaren’s NaturalsKashiKendy USAKevalaKevin LevroneKiller LabzKIND BarsKing Arthur FlourKing ProteinKinnikinnick FoodsKirkland SignatureKirkman LabsKroeger Herb CoKuli KuliKuumba MadeKyolicL’il CrittersLa TourangelleLabrada NutritionLaird SuperfoodLakantoLake Avenue NutritionLAWLESS LABSLean & PureLecheek NutritionLenny & Larry’sLevel UpLiddellLife EnhancemenLife EnhancementLife ExtensionLife Flo HealthLife SeasonsLife Source Basics (WGP Beta Glucan)Life TimeLife-floLifeSeasonsLifeTime VitaminsLily of the DesertLipo NaturalsLiquid Health ProductsLittle DaVinciLONNIX SDNLypriCelMaca MagicMacrolife NaturalsMADMad Hippie Skin Care ProductsMadre LabsMamma ChiaMAN SportsManitoba HarvestManuka DoctorManuka HealthManukaGuardMapMars IncorporatedMason NaturalMaster SupplementsMatcha RoadMate FactorMaximum Human Performance, LLCMaximum InternationalMaxlerMcCormick GourmetMeatSmartMED-TEK SeriesMediNaturaMegaFoodMET-RxMetabolic MaintenanceMetabolic NutritionMEX NutritionMezotraceMHPMichael’s NaturopathicMichelle’s MiracleMinami NutritionMineral FusionMommy’s BlissMonoi Tiare TahitiMontana Big SkyMoomMorningstar MineralsMr. DominantMr.DjemiusZEROMRIMRMMt. CapraMultipowerMunchkinMuscle ArmyMuscle CareMuscleMaxxMuscleMedsMusclePharmMusclePharm NaturalMuscletechMushroom WisdomMutantMyOgenixMyproteinMYTHICAL NUTRITIONMyWayNaka Herbs & Vitamins LtdNamaste FoodsNanoxNanox NutriceuticalsNapoleon Co.NatraBioNatrolNaturadeNatural BalanceNatural CareNatural DynamixNatural FactorsNatural Path Silver WingsNatural SourcesNatural SportNatural VitalityNaturally VitaminsNaturaNectarNature MadeNature RepublicNature’s AlchemyNature’s AnswerNature’s BestNature’s Best, IsoPureNature’s BountyNature’s HerbsNature’s LifeNature’s PathNature’s PlusNature’s SecretNature’s SourcesNature’s WayNATURELONatureWiseNavitas OrganicsNeemaura NaturalsNeilMedNeocellNestle Toll HouseNeuroScienceNeuroScience, Inc.New ChapterNew Nordic US IncNigen BiotechNight TimeNLA for HerNO BrandNo CowNO nameNordexNordic NaturalsNorth American Herb & Spice Co.NovaFormeNow FoodsNoxygenNTel NutraNu U NutritionNubreedNUCONuGo NutritionNumi TeaNuNaturalsNurture Inc. (Happy Baby)NutivaNutra BioGenesisNutra InnovationsNutrabio LabsNutraceutical Solutions, IncNutraLeaf NutritionNutraLifeNutrex HawaiiNutrex Research LabsNutri-FruitNutri-FusionNutriBioticNutricologyNutricoreNutriLabsNutrition NowNuun HydrationO’Donnell Formulas, Flora BalanceOh Yeah!OjioOla LoaOlimpOlymp powerOlympian Labs Inc.Om MushroomsOmegaViaOmegavitOne BrandsOne with NatureOne-A-DayOnnitOOH Snap!OptiMealOptimox CorporationOptimum NutritionOptimum SystemOraOralgenOregons Wild HarvestOrgainOrganic EvolutionOrganic ExcellenceOrganic FijiOrganic IndiaOrganic Mushroom NutritionOrganic TraditionsOslomegaOsteo Bi-FlexOstroVitOtto’s NaturalsOutbreak NutritionOvega-3OWYNOxyLifePalmersPamela’s ProductsPangea OrganicsParadise HerbsParissaPeanut Butter & Co.Percent AshitabaPerformancePerformaxPFN NutritionPhantom Athletics TrainingMaskPharma FirstPharma first nutritionPharma LegalPharmacom LabsPharmaton Natural HealthPhase One NutritionPhillipspHion BalancePhyto Therapy Inc.Pink FitPink StorkPioneer Nutritional FormulasPique TeaPitbull LabsPitchblack SupplementsPlanetary HerbalsPlantFusionPlatinum LabsPlum OrganicsPondera, The Endorphin CompanyPopeyePower ProPower SystemPowerBarPowerLabsPremamaPremier OnePrimaforcePrimal KitchenPrime NutritionPrimeval LabsPrince of PeaceProBarProbulinProgressiveProLabPromax NutritionPromensilProMera SportsPronaturaProSuppsProteinRexProtocol for Life BalancePukka HerbsPure AdvantagePure BarPure EssencePure Fit BarsPure Indian FoodsPure PlanetPure ProteinPure VeganPurely InspiredPureMark NaturalsPurity ProductsPVLEssentialQitropeQNTQuality of Life LabsQuantum HealthQuest NutritionQunolR.E.D. LabsRael, Inc.Rainbow LightRainbow ResearchRAPIDFIRERapunzelRaw FusionRaw RevolutionRawFusionRawmioReal Aloe Inc.Real PharmRebody SafslimRed LabsRedcon1Redd RemediesReebokRegeneration PharmRejuvicareRenegade LabsRenew LifeReserveage NutritionRestoreRevange NutritionReviva LabsRexall Sundown NaturalsRich Piana 5% NutritionRidgeCrest HerbalsRio LabsRise BarRishi TeaRobert Research LabsRonnie ColemanRoyal NutritionRoyal TropicsRPS NutritionRSP NutritionRSP Nutrition, LLCRugeRun Everything LaboratoriesRun GumRXBARSage ResearchSambazonSAN NutritionSanta Barbara BarSavestaScandinavian FormulasSchiffScitec EssentialsScitec NutritionScivationSculptor NutritionSeaBuckWondersSeagateSeapoint FarmsSedona LabsSencha NaturalsShikaiSian Chinese Drug PharmaceuticalSibu BeautySierra BeesSierra FitSilicium Laboratories LLCSimilasanSimple MillsSimply OrganicSinolSir Kensington’sSix StarSkin By Ann WebbSKRATCH LABSSky OrganicsSlim JamSmartShakeSmartyPantsSolaraySolgarSolumeveSomatexSonne’sSource NaturalsSovereign SilverSoviet LabsSparta NutritionSpectrum EssentialsSpectrum NaturalsSport Technology NutritionSports ResearchSprout LivingSquarebarST Biotechnology Co LtdSt. DalfourStars & Stripes NutritionStarwest BotanicalsStash TeaSteel PowerStoneridge OrchardsStrengthtapeStridexSun ChlorellaSun PotionSunbioticsSundesaSundown Natural’s KidsSundown NaturalsSundown Naturals KidsSundown OrganicsSunfoodSunlipidSunny GreenSunwarriorSuper Hero SeriesSuper NutritionSuperior SourceSupplementsSwisseSymbioticsSyntraxT.RQTazo TeasTeamiTera’s WheyTeras WheyTerra OriginTerrasoul SuperfoodsThe Synergy CompanyThe Tao of TeaTHEMRATheraBreathThinkThinkThinThis Bar Saves Lives, LLCThompsonThorne ResearchTitanTLM ResearchTPCSTrace Minerals ResearchTraditional MedicinalsTree of LifeTreehouse KidsTriple Leaf TeaTwinlabUltaminsUltima Health ProductsUltimate NutritionUltra Glandular EnterprisesUltra LaboratoriesUNDERPHARM LABSUniforceUniversal NutritionUpSpringUSAUSNUSPlabsVAMPvascoVaxa InternationalVegaVeganSmartVegLifeVermodjeVermont Village Vinegar ShotsVibrant HealthVita LogicVitablesVitacostVitaFusionVital Earth MineralsVital PlanetVital ProteinsVitalahVitamin FriendsVitaminderVitanicaVP LaboratoryVPX SportsWakunaga — KyolicWalden FarmsWebber NaturalsWedderspoonWeiderWell WisdomWellesse Premium Liquid SupplementsWestPharmWhite Egret Personal CareWhole World BotanicalsWholesome SweetenersWild Zora Foods LLCWilderness Poets LLCWiley’s FinestWillardWobenzymWobenzym NWorld OrganicWTF LabzXcel NutritionXenadrineXlear Inc (Xclear)XLSNXyloburstY.S. Eco Bee FarmsYerba PrimaYogi TeaYogourmetYoutheoryYum-VsYumEarthYUPZ!NTZ!NT LLCZahlerZandZarbee’sZarbeesZenwise HealthZesty PawsZhongshan Hygene Biopharm Co.Zhou NutritionZing BarsZINTZion LabsZOI ResearchZombiLabZonePerfectZPHCЁ/батонМНОГО ПОЛЬЗЫ

Новинка:

Вседанет

Спецпредложение:

Вседанет

Результатов на странице:

5203550658095

Найти

Цистеин (англ. Cysteine) — алифатическая серосодержащая аминокислота. Существует в виде L- и D- изомеров. L-Цистеин входит в состав белков, играет важную роль в процессах формирования тканей кожи. Имеет значение для дезинтоксикационных процессов.

Биологические функции цистеина:

Мощный антиоксидант;
Оказывает защитное действие на клетки печени и головного мозга от повреждения алкоголем, некоторыми лекарственными препаратами и токсическими веществами, содержащимися в сигаретном дыме;
Способствует пищеварению, участвуя в процессах переаминирования;
Способствует обезвреживанию некоторых токсических веществ и защищает организм от повреждающего действия радиации;
Способствует более быстрому восстановлению и поддержанию хорошей физической формы;
Используется для синтеза таурина и глютатиона;
Снижает вредное воздействие алкоголя на мышцы;
Улучшает пищеварение и защищает стенку пищеварительного тракта.

Эффективное сочетание цистеина

Что бы получить максимальный эффект от цистеина, рекомендуется сочетать его с витамином Е, витамином С, витамином В6, кальцием и селеном. Эти вещества, как правило содержатся в витаминно-минеральных комплексах.

Дозы и режим приема

Рекомендуемая доза цистеина в бодибилдинге 1-2 г в сутки. Принимайте цистеин по 500 мг 1-4 раза в сутки. Не превышайте дозу более 5 г, это может быть вредно для здоровья. Запивайте каждую порцию цистеина стаканом воды.

N-ацетилцистеин.

N-ацетилцистеин — это измененная форма цистеина — аминокислоты, помогающей организму синтезировать глютатион (антиоксидант, участвующий в активизации иммунитета). Эта добавка применяется в лечении респираторных заболеваний, включая острый и хронический бронхит. Более того, она может помочь в лечении сердечно-сосудистых заболеваний и быть эффективной при лечении диабета и некоторых видов рака.

Что касается применения в спортивной сфере, N-ацетилцистеин тестировался в основном на атлетах тех видов спорта, где требуется повышенная выносливость. В одном исследовании восемь мужчин принимали N-ацетилцистеин или плацебо в процессе 45-минутной работы на велотренажере с высокой степенью интенсивности, имитирующей гонку. N-ацетилцистеин улучшил спортивные показатели на 26%. Вероятно, это произошло вследствие его способности увеличивать количество кислородосодержащих молекул и уменьшать процесс окисления в мышцах. Пока еще слишком рано говорить о том, станет ли N-ацетилцистеин по-настоящему эффективной добавкой, но он заслуживает нашего внимания.

Цистеин — обзор | Темы ScienceDirect

2.1 Недолговечный железо-диоксидный комплекс в ферментах цистеиндиоксигеназы

Катаболизм цистеина — жизненно важный процесс для здоровья человека, и его первый шаг опосредуется CDO. Хотя цистеин является одной из аминокислот, образующих строительные блоки многих белков в клетках, его накопление в нейрональных клетках, как известно, является эксайтотоксичным, а повышенные уровни цистеина коррелируют с нейродегенеративными заболеваниями (74,75) .Однако было обнаружено, что повышенная активность CDO является результатом принудительной экспрессии его гена в раковых клетках человека, что также коррелирует со снижением роста опухолевых клеток (76) . Таким образом, каталитическая активность CDO и ее регуляция обеспечивают поддержание постоянного физиологического уровня цистеина.

CDO катализирует превращение цистеина в цистеинсульфиновую кислоту, что является первой необратимой стадией катаболизма цистеина (77,78) . Детали каталитического механизма CDO остаются неполными, и поэтому механизм еще не установлен.В частности, не сообщалось об экспериментальных данных по промежуточным соединениям, связанным с дикислородом, в ферментах CDO; следовательно, все предложения по короткоживущим промежуточным продуктам исходили из анализа распределения продуктов и компьютерного моделирования (35–39,79) . Последующие экспериментальные работы и компьютерные исследования биомиметических модельных комплексов дали представление об активации двуокиси кислорода и предсказали общий механизм реакции CDO (39,80,81) .

На рис. 3 представлены основные промежуточные соединения в каталитическом цикле ферментов CDO.Цикл начинается с комплекса состояния покоя ( R ), который представляет собой негемовое железо (II), связанное с белком посредством трех взаимодействий с остатками гистидина, в то время как другие три позиции лиганда заняты молекулами воды. Система координации лиганда отличает CDO от типичных негемовых диоксигеназ железа, которые имеют свойство 2-His / 1-Asp, как обсуждалось ранее. Цикл начинается с того, что цистеинат входит в карман связывания субстрата и связывает комплекс железа (II) в качестве бидентатного лиганда с тиолатной и амидной группами с образованием структуры A .Последняя молекула воды вытесняется из центра железа, когда дикислород входит в состав железо (III) -супероксокомплекса ( B ). Этот комплекс неуловим и не был обнаружен и охарактеризован для негемовой диоксигеназы железа. Дистальный атом кислорода (обозначенный O _d) атакует тиолат с образованием мостиковой структуры C . Стадия разрыва связи O – O дает соединения железа (IV) -оксо и промежуточное соединение сульфоксида цистеина ( D ), которое после переноса второго атома кислорода дает продукты цистеинсульфиновой кислоты ( E ).Высвобождение продукта и повторное связывание воды возвращает активный центр в состояние покоя R и завершает каталитический цикл.

Рис. 3. Каталитический цикл цистеиндиоксигеназы.

Исследования поглощения UV – Vis выявили две полосы поглощения при 500 и 640 нм для частиц, содержащих два атома кислорода (82) . К сожалению, промежуточные распады за 20 мс и попытки охарактеризовать короткоживущие частицы в дальнейшем не увенчались успехом, и неразличимых спектров ЭПР и мессбауэра получено не было.Поэтому мы прибегли к вычислительным исследованиям на уровне теории функционала плотности, зависящей от времени (TD-DFT) и на уровне теории полного активного пространства — самосогласованного поля (CASSCF), чтобы установить природу промежуточного звена. В частности, основное внимание было уделено двум реакционноспособным промежуточным продуктам, а именно супероксоаниону железа (III) ( B ) и кольцевой структуре бициклического O – O железа (III) ( C ), а также сульфоксиду цистеина ( D ) и продукты цистеинсульфиновой кислоты ( E ).

Данные экспериментов с использованием мессбауэровской спектроскопии установили наличие связанной с водой структуры (с водой в шестом положении лиганда, т. Е. Структура A на рис. 3) цистеин-связанной CDO, но только цистеин-CDO будет идти. через реакцию диоксигенирования в соответствующих условиях (82) . Было замечено, что когда анаэробный цистеин-связанный CDO титровался насыщенным кислородом буфером при 4 ° C в перчаточном боксе, это приводило к появлению двух пиков поглощения при 500 и 640 нм.Было обнаружено, что эти пики линейно масштабируются с концентрацией CDO, а также с количеством подаваемого кислорода. Поскольку частицы с характеристиками поглощения 500 и 640 нм распадаются в течение примерно 20 мс, было предложено быть аддуктом кислорода в каталитическом цикле CDO. Измерена константа скорости его распада первого порядка 112 ± 5 с ^{— 1}. Результаты были дополнительно подтверждены с помощью различных экспериментальных методов, таких как химическое гашение и гашение замораживанием, что дало такие же результаты реакций диоксигенации для анаэробного цистеин-связанного CDO (82) .

Кроме того, компьютерное моделирование с использованием теории функционала плотности на модельных комплексах, а также исследования QM / MM на полном ферменте рассчитали высокие реакционные барьеры для образования железо (III) -супероксо и железо (III) -бициклических кольцевых форм. , и, следовательно, эти расчеты предсказали конечное время жизни двух комплексов B и C (35,37) . С другой стороны, образование продуктов сульфоксида железа и цистеина и сульфиновой кислоты железо-цистеин считается сильно экзотермическим с небольшими барьерами образования и распада.Следовательно, ожидается, что время жизни этих промежуточных продуктов будет довольно коротким.

На рис. 4 показаны рассчитанные спектры поглощения структур железо (III) -супероксо ( B ), бициклического комплекса ( C ), комплекса сульфоксид железа-цистеина ( D ) и железо-сульфоксида. комплекс продукта цистеинсульфиновой кислоты ( E ) в квинтетном спиновом состоянии с помощью методов TD-DFT и CASSCF. Хотя ни один из спектров поглощения не воспроизводит идеально эксперимент, некоторые особенности воспроизводятся хорошо.Во-первых, как было предсказано расчетами механизма реакции с помощью DFT и QM / MM и подтверждено с помощью TD-DFT и CASSCF, структуры ⁵ D и ⁵ E могут быть исключены как промежуточные продукты, ответственные за особенности поглощения в экспериментальном спектре. Либо спектроскопический сигнал в нужном месте не виден, либо сигнал не виден вообще для обоих промежуточных соединений. Во-вторых, результаты CASSCF предполагают наличие двух четких сигналов поглощения в области 500-700 нм как для ⁵ B , так и для ⁵ C , в результате чего интенсивность пиков для ⁵ C , по-видимому, соответствует лучше всего экспериментируйте, хотя оба пика сдвинуты относительно экспериментального задания.Таким образом, вычислительный анализ выявил двух возможных кандидатов, ответственных за экспериментально наблюдаемые максимумы поглощения, а именно ⁵ B или ⁵ C . Теория немного поддерживает отнесение ⁵ C , но ошибка расчетов слишком велика для окончательного вывода. К сожалению, теория не может разрешить экспериментальную загадку и определить единственные частицы, ответственные за спектры поглощения, но результаты в основном указывают на бициклическую кольцевую структуру в квинтетном спиновом состоянии как на частицы, дающие экспериментальные спектры.Таким образом, потребуется дальнейшая аналитическая работа, чтобы различать эти два вида, особенно с использованием аналитических инструментов, которые могут обнаруживать их за более короткое время, например, менее чем за 10 мс, чтобы определить роль и природу кислородного аддукта. промежуточные продукты в каталитическом цикле CDO.

Рис. 4. TD-DFT и CASSCF рассчитали спектры поглощения короткоживущих интермедиатов каталитического цикла CDO.

Перекрестные помехи между цистином и глутатионом имеют решающее значение для регуляции сигнальных путей аминокислот и ферроптоза.

Материалы

Рапамицин (Rapa) был приобретен у Tocris Bioscience (Бристоль, Великобритания).Циклогексимид (CHX), туникамицин (TUN), 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин (DON), восстановленный L-глутатион (GSH), восстановленный этиловый эфир глутатиона (GSHee) были от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США). Миссури, США). OU749, бутионинсульфоксимин (BSO) и ферростатин-1 (Fer-1) были от Cayman Chemicals (Анн-Арбор, Мичиган, США). Антитела, специфичные к киназе p70S6, киназе фосфо-p70S6 (Thr 389), рибосомному белку S6, рибосомному белку фосфо-S6 (Ser 235/236), eIF2α, фосфо-eIF2α (Ser 51), PERK, Bip и пероксидазе хрена (HRP) -связанные вторичные антитела были от Cell Signaling Technology (Данверс, Массачусетс, США).Антитело, специфичное к фосфо-GCN2 (Thr 899), было от Abcam (Кембридж, Великобритания). Антитело ATF4 было от Santa Cruz Biotechnology (Даллас, Техас, США).

Обработка клеток

Клетки гепатомы HepG2 поддерживали в среде DMEM (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C за 5 дней. % CO _{2 900 26. Если не указано иное, среду без цистина готовили путем добавления DMEM, не содержащей цистина, метионина и глутамина (Gibco, Калифорния, США), с 100 мкМ метионина, 4 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0.2% бычий сывороточный альбумин (BSA), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Контрольная среда содержала 100 мкМ цистина. Для анализа жизнеспособности клеток в среду добавляли 10% диализованный FBS. Для анализа GSH клетки обрабатывали сбалансированным солевым раствором Эрла (EBSS) с добавлением 25 мМ глюкозы, 4 мМ глутамина, 1 х раствор витаминов MEM (Life Technologies, Калифорния, США), 0,22% масс. / Об. NaHCO ₃, 1 мМ пируват натрия, 0,2% БСА, 25 мМ HEPES, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в присутствии или в отсутствие 1 X раствора аминокислоты MEM (Gibco, Калифорния, США) с цистином 100 мкМ или без него.Для измерения АФК и перекисного окисления липидов клетки обрабатывали в DMEM, не содержащей фенолового красного, с 10% диализованным FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина с цистином или без него.}

Вестерн-блот

Клетки HepG2 гомогенизировали на льду с буфером RIPA, дополненным ингибиторами фосфатазы и протеаз (Pierce, Thermo Scientific, MA, США). Лизат клеток обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 14000 об / мин при 4 ° C для удаления остатков клеток. Белки денатурировали в буфере для образцов и равные количества разделяли на SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF (BioRad Laboratories, Калифорния, США).Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Твин 20, в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Вторичное антитело, конъюгированное с HRP, использовали для обнаружения белка с хемилюминесценцией.

Количественная ПЦР в реальном времени

РНК

очищали с использованием ReliaPrep RNA (Promega, WI, США), и проводили обратную транскрипцию с использованием 1,5 мкг общей РНК в качестве матрицы с системой обратной транскрипции ImProm-II (Promega, WI, США). .ПЦР в реальном времени выполняли на системе ABI 7300 Real-Time PCR System (Life Technologies, Калифорния, США) с использованием SYBR Green Select Master Mix (Applied Biosystems, Калифорния, США). Данные были проанализированы с использованием относительного количественного метода путем нормализации уровня мРНК всех генов относительно уровня гена β-актина.

Измерение GSH

Среду собирали для определения внеклеточного общего уровня GSH, и клетки гомогенизировали в 5% дигидрате 5-сульфосалициловой кислоты (SSA, Sigma-Aldrich, MO, USA) на льду.Супернатант собирали после центрифугирования для измерения внутриклеточного GSH. Осадок растворяли в 100 мкл буфера RIPA и определяли содержание белка. Общий GSH измеряли с использованием набора для колориметрического определения глутатиона (Arbor Assays, Мичиган, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение активных форм кислорода и перекисного окисления липидов

Клетки инкубировали с 5 мкМ BODIPY 581/591 C11 (Life technologies) для перекисного окисления липидов или 5 мкМ CM-h3DCFDA (Life technologies) для ROS в темноте в течение 30 минут при 37 ° С.Затем клетки собирали трипсинизацией, один раз промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и ресуспендировали в 300 мкл среды DMEM, не содержащей фенола красного, с 0,2% бычьим сывороточным альбумином. Флуоресценцию анализировали с использованием проточного цитометра (BD FACSCanto ™ II, BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), оборудованного лазером 488 нм для возбуждения. Данные собирали с использованием полосового фильтра 530/30 нм.

Анализы жизнеспособности клеток

Клетки обрабатывали в 96-луночном планшете в течение 48 часов и инкубировали с 5 мг / мл 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ, Sigma- Aldrich) в течение 4 ч при 37 ° C в темноте.После удаления среды в каждую лунку добавляли ДМСО для растворения кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Определение гибели клеток путем окрашивания PI

Клетки трипсинизировали, промывали PBS и суспендировали в 300 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) с добавлением 0,2% BSA, содержащего 0,3 мкг / мл йода пропидия (PI, Sigma-Aldrich). После 30 минут инкубации при 37 ° C в темноте процент PI-положительных клеток определяли с помощью проточного цитометра (BD FACSCanto ™ II, BD Biosciences) с лазером для возбуждения 488 нм и полосовым фильтром 585/42 нм.Процент мертвых клеток был представлен как% PI-положительных клеток на основе 10 000 событий на образец.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего или ± стандартное отклонение как минимум для 3 независимых повторов. Различия между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим анализом наименьших значимых различий Фишера post hoc . Достоверность принималась при p <0,05.

Связь между наличием цистеина в белках и сложностью организмов | Молекулярная биология и эволюция

Абстрактные

Встречаемость и относительное положение остатков цистеина были исследованы в белках различных видов.Учитывая случайное математическое появление аминокислоты, кодируемой двумя кодонами (3,28%), цистеин недостаточно представлен во всех исследованных организмах. Представленность цистеина, по-видимому, положительно коррелирует со сложностью организма, варьируя от 2,26% у млекопитающих до 0,5% у некоторых представителей отряда Archeabacteria . Это наблюдение вместе с результатами, полученными при сравнении содержания цистеина в различных рибосомных белках, указывает на то, что эволюция использует преимущества увеличения использования остатков цистеина.Во всех изученных организмах, кроме растений, два цистеина часто обнаруживаются на расстоянии двух аминокислотных остатков (мотив C- (X) ₂ -C). Известно, что такой мотив присутствует во множестве металлсвязывающих белков и оксидоредуктаз. Примечательно, что более 21% всех цистеинов было обнаружено в мотивах C- (X) ₂ -C в Archea. Это наблюдение может указывать на то, что цистеин сначала появился в древних металлсвязывающих белках, а позже был введен в другие белки.

Введение

Цистеин уникален среди кодируемых аминокислот, поскольку он содержит реактивную сульфгидрильную группу.Следовательно, два остатка цистеина могут образовывать цистин (дисульфидную связь) между различными частями одного и того же белка или между двумя отдельными полипептидными цепями. Образование дисульфидной связи связано со сворачиванием белка и поддерживается ферментами тиолдисульфид оксидоредуктаза и протеиндисульфидизомераза (Loferer and Hennecke 1994; Noiva 1994; Raina and Missiakas 1997). Известно, что цитозольные белки содержат относительно мало дисульфидных связей, а системы глутаредоксина и тиоредоксина участвуют в поддержании групп -SH в восстановленной форме (Derman et al.1993; Стюарт, Ослунд и Беквит, 1998 г .; Чжун и др. 1998).

Простые структурные ограничения также могут мешать взаимодействию цистеинов. Из-за жесткой планарной природы пептидной связи два соседних цистеина не могут взаимодействовать. То же самое верно, если два цистеина разделены только одной аминокислотой. Основываясь на физических размерах и выравнивании аминокислотных остатков в конфигурациях альфа-спирали и бета-поворотов, два цистеина наиболее близки друг к другу, когда они разделены двумя другими аминокислотами (мотив C- (X) ₂ -C; X может стоять для любой кодированной аминокислоты).В самом деле, известно, что мотивы C- (X) ₂ -C являются хорошо законсервированными частями различных железо-серных белков и оксидоредуктаз (Shuber et al. 1986; Ammendola et al. 1992). Однако мы признали, что появление доменов C- (X) ₂ -C не ограничивается этими группами белков. Кроме того, количество доменов C- (X) ₂ -C оказалось удивительно высоким в большой случайно выбранной популяции известных белков Saccharomyces cerevisae .

Эти наблюдения побудили нас проанализировать, возникли ли цистеины случайным образом или организованы преимущественно в мотивы C- (X) ₂ -C в известных белках различных видов.Перед проведением такого анализа необходимо было проанализировать наличие цистеинов и других кодируемых аминокислот в белках различных видов. Цистеин кодируется триплетами кодонов UGU и UGC соответственно. Все известные организмы содержат цистеины в своих белках.

Поскольку все известные живые организмы содержат одни и те же 20 кодированных аминокислот, нет прямого способа узнать, была ли та или иная аминокислота введена раньше или позже в процессе эволюции. С другой стороны, жизнь на Земле могла возникнуть с примитивных организмов, содержащих известные 20 кодированных аминокислот.Доказательства, подтверждающие постепенное расширение генетического кода, в первую очередь основаны на аномальном распределении кодонов у различных видов (Osawa et al. 1992; Bauman and Oro 1993).

Кроме того, Doring и Marliere (1998) показали, что мутантные тРНК, которые включают цистеин в положениях, соответствующих кодонам изолейцина или метионина, могут сохраняться в Escherichia coli. Токсичность неправильного кодирования цистеина была низкой, что доказывает, что цистеин является приемлемой заменой в большинстве положений белка.Таким образом, включение цистеина может преодолеть стерические и полярные ограничения, которые ограничивают эволюцию генетического кода.

Следовательно, возможно, что цистеин был введен на относительно поздней стадии эволюции путем заимствования некоторых кодонов другой аминокислоты (серин, глицин). Если синтез боковой цепи аминокислоты прогрессирует с помощью того же или аналогичного пути (путей) биосинтеза, полученные аминокислоты физико-химически подобны (например, Ile, Val, Leu, Phe, Tyr, Asp, Glu) (Miseta 1989) .Важно отметить, что физико-химически родственные аминокислоты занимают аналогичные кодоны (Jungck 1978; Weber and Lacey 1978). Следовательно, генетический код разработан таким образом, чтобы свести к минимуму вероятность того, что изменение одного нуклеотидного основания приведет к замене на физико-химически другую аминокислоту.

Результатом нецелевого введения цистеина должно было быть то, что многие цистеины оказались не в «оптимальных местах». Последующая эволюция должна была исправить эти «ошибки», оставив цистеины в положениях, где их физико-химические свойства могли быть использованы на благо организма.Одновременно мутации, приводящие к триплетам, кодирующим цистеин, способствовали развитию новых, более сложных белков.

На основании этой гипотезы можно было ожидать найти простые организмы с относительно небольшим количеством цистеинов и сложные организмы со значительно большим количеством цистеинов. Точно так же можно ожидать обнаружения цистеинов в ограниченном количестве белковых доменов у простых организмов.

В настоящем отчете мы пытаемся выделить взаимосвязь между сложностью различных организмов и наличием цистеина в их белках.

Материалы и методы

Последовательности белков, файлы данных последовательностей и анализ аминокислотного состава

Анализ последовательностей проводился на файлах данных последовательностей, созданных из последовательностей, хранящихся в базе данных SwissProt (CDPROT31). Файлы данных последовательности были созданы с помощью правила выбора. В правиле отбора указывается научное название вида. Если указано, также было указано субклеточное расположение белков.Затем были отредактированы сохраненные файлы данных, содержащие каталоги последовательностей белков. Это редактирование ограничивалось удалением нескольких поврежденных файлов последовательностей, для которых последующие программы анализа данных не могли работать.

Были созданы следующие файлы данных: Homo sapiens (человек), 2681 последовательность белка; Mus musculus (мышь), 1727; Bos taurus (крупный рогатый скот), 719; Drosophila melanogaster (плодовая муха), 624; Caernorhabditis elegans, 690; Zea mays (кукуруза), 287; Orysa sativa (рис), 219; Lycopersicon esculentum (томат), 117; Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи), 3 127; E.coli, 3151; Rhodobacter sphaeroides, 58; Pseudomonas aeruginosa, 214; Haloarcula marismortui ( ранее Halobacterium marismortui ), 62; и Thermus aquaticus, 88. В некоторых случаях для анализа использовались белки родственных видов. Файлы данных для различных Cyanobacteria содержали 556 последовательностей, файлы для Archea содержали 553 последовательности, а файлы для Sulpho-archea содержали 137 последовательностей.Файлы данных для рибосомных белков включали 66 последовательностей для людей, 134 последовательности для дрожжей, 59 последовательностей для E. coli, и 51 последовательность для H. marismortui.

Поскольку данные были сгенерированы и предназначались для сравнения файлов данных, содержащих разное количество последовательностей белков, было важно рассчитать стандартные отклонения любых результатов для файлов данных меньшего и большего размера. Поэтому мы сгенерировали пять файлов данных, каждый из которых содержит 50 последовательностей S. cerevisiae из , с помощью случайного генератора.Встречаемость 20 кодированных аминокислот была проанализирована в пяти файлах данных, и были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения. Мы обнаружили, что в этом случае среднее значение SD для 20 аминокислот составляло 5,57%. Например, мы обнаружили 291,2 ± 36,8 остатков цистеина (среднее ± стандартное отклонение). Когда каждая из пяти баз данных S. cerevisiae содержала 100 или 200 случайно выбранных последовательностей белков вместо 50, средние значения SD снизились до 3,50% и 2,21% соответственно.

Несомненно, файлы данных меньшего размера не отражают средний белковый состав вида, а также более крупные.Мы также отмечаем, что эти файлы данных были созданы не генератором случайных чисел, а скорее специфическими интересами исследователей. По этой причине мы хотели быть максимально осторожными при интерпретации данных в небольших файлах данных. Файл данных, содержащий менее 50 последовательностей, не использовался. Кроме того, создание комбинированных файлов данных по родственным видам с большим количеством последовательностей было направлено на уменьшение стандартной ошибки.

Был проанализирован аминокислотный состав белков в файле данных, при этом общее количество 20 кодированных аминокислот составило 100%.Содержание цистеина (и любой другой аминокислоты) выражали как процент от общего количества аминокислот.

Коррекция данных аминокислотного состава для содержания ГХ по сравнению с содержанием AT кодирующей ДНК

Известно, что содержание GC по сравнению с содержанием AT кодирующих последовательностей варьируется в широком диапазоне у разных видов. Цистеин может кодироваться UGU или UGC. Следовательно, только содержание GC в положении первого и второго кодона влияет на появление цистеина.Общее количество кодирующих GC и усредненное содержание GC первой и второй буквы кодона (значения выделены курсивом) видов, перечисленных в отчете, следующие: люди — 52,75%, 49,24% ; крупный рогатый скот — 52,86%, 48,37% ; мыши — 52,76%, 49,25% ; D. melanogaster —54,53%, 48,95% ; C. elegans —42,37%, 43,94% ; кукуруза — 55,69%, 50,67% ; рис — 56,16%, 51,03% ; томаты — 42,74%, 45,26% ; С.cerevisae —39,72%, 40,60% ; Цианобактерии — 32,36%, 41,8% ; E. coli —51,37%, 49,60% ; R. sphaeroides —67,86%, 57,69% ; P. aureginosa —64,06%, 55,09% ; H. marismortui —63,69%, 55,00% ; T. aquaticus —66,57%, 55,45 %; Сульфоархея —43,12%, 45,71%.

Ожидается, что увеличение содержания GC в положении первого кодона окажет отрицательное влияние на содержание цистеина в биологических видах, поскольку первая буква кодона — U.Увеличение содержания GC второй буквы кодона должно иметь положительный эффект на содержание цистеина, потому что вторая буква кодона — G. Кроме того, (A + U) + (G + C) = 1 (где 1 — общее количество нуклеотидов. содержание вида). Поскольку (G + C) = 1 — (A + U), связь между вероятностью кодирования цистеина (Pcys) и содержанием (G + C) кодирующей ДНК может быть описана как Pcys = (G + C) * (1 — (G + C)). Поскольку кривая вероятности довольно плоская в диапазоне содержания GC от 40% до 60%, скорректированные значения никогда не отличаются от исходных данных более чем на 3.5%. В тексте и / или в подписях к рисункам указывается, были ли данные скорректированы с учетом фактического содержания GC для видов.

Анализ аминокислотного расстояния и гомологии белков

Вышеупомянутые файлы данных использовались для анализа встречаемости различных аминокислотных последовательностей. Анализировали наличие последовательности C- (X) _n -C. C — однобуквенная метка для цистеина, X — любая другая аминокислота, и n — количество повторов, 0–22 в наших исследованиях.Поскольку последовательность зондов C- (X) _n -C может быть наложена на любую последовательность заданной длины еще раз, чем последовательность зондов C- (X) _{n +1} -C, соответствующая коррекция может осуществляться. Однако мы обнаружили, что полученная поправка не повлияла существенно на наши результаты, и по этой причине она была опущена.

Для последовательности C- (X) ₂ -C мы также проанализировали наличие всех индивидуальных последовательностей в файлах данных людей, плодовых мух, E.coli, и Archea. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили в соответствии с методом, разработанным Myers and Miller (1988). Мы использовали структурную генетическую матрицу, основанную на работе Фенга, Джонсона и Дулиттла (1984) с ценой открытого пробела 10 и стоимостью единицы пробела 5.

Результаты

Встречаемость цистеина в белках разных видов

Во-первых, мы исследовали наличие цистеина в известных белках различных видов.Для этого были подсчитаны встречаемости 20 кодированных аминокислот в репрезентативных образцах (файлах данных) людей, крупного рогатого скота, мышей, плодовых мух, C. elegans, кукурузы, риса, томатов, дрожжей, цианобактерий, цианобактерий. E. coli, R. sphaeroides, P. aeruginosa, H. marismortui, T. aquaticus, и Sulpho-archea. Сумма всех 20 кодированных аминокислот считалась 100%.

Цистеин — относительно редкая аминокислота в составе белков исследованных организмов (рис.1). Анализы белков человека, крупного рогатого скота и мыши выявили почти идентичные (2,26%) встречаемости цистеина. Белки плодовой мушки C. elegans содержали несколько меньше цистеина (1,90% и 1,97% соответственно). Белки кукурузы, риса и томатов содержат 1,62–1,69% цистеина. Среди исследованных эукариот дрожжи содержали меньше всего цистеина (1,21%).

Среди исследованных прокариот цианобактерий, E. coli, P. aeruginosa, и R. sphaeroides содержали 1.3–1,13% цистеина, что несколько меньше, чем у S. cerevisiae.

Были также изучены представители вновь созданного ордена Archea (Woese, Gupta, 1981; Woese, Kandler, and Wheelis, 1990). Мы обнаружили, что содержание цистеина у крайнего галофила H. marismortui и термофила T. aquaticus было самым низким среди исследованных видов (0,49% и 0,41% соответственно). Точно так же низкое представительство цистеина очевидно у Halobacterium salinarium (данные не показаны) и членов группы Sulpho-archea .Все данные были скорректированы с учетом фактического содержания видов в ГХ (использованного в качестве фоновой вероятности), как описано в «Материалы и методы».

Отметим, что фактические и скорректированные по ГХ уровни цистеина были почти идентичны для большинства видов. (Наибольшая разница между этими значениями была у S. cerevisiae, , для которых фактическое содержание цистеина составляло 1,25%, тогда как скорректированный GC был 1,21%.)

В то время как белки порядка Archea могут содержать от четырех до В пять раз меньше цистеина, чем в белках млекопитающих, похоже, что цистеин недостаточно представлен во всех исследованных организмах.Учитывая, что у этих организмов 61 смысловой кодон и два кодона отнесены к цистеину, (100/61) × 2 = 3,28%. Диапазон вероятности с поправкой на GC составляет 3,23–3,28% для изученных видов.

Мы также подсчитали количество белков с хотя бы одним остатком цистеина и без него у некоторых видов. На рисунке 2 показано, что около 92% белков человека содержат один или несколько остатков цистеина. Аналогичные числа были получены для белков плодовой мухи и дрожжей. Умеренное увеличение количества белков, не содержащих цистеина, очевидно для E.coli, , но более 50% известных белков H. marismortui не содержат ни одного остатка цистеина. Аналогичные проценты могут быть получены для других родственных видов, перечисленных на рисунке 1.

Отметим, что средние длины белков не равны в разных файлах данных (видах) (подробности см. В Материалы и методы ).

Встречаемость цистеина в рибосомных белках различных видов

Известно, что одна или несколько дисульфидных связей часто обнаруживаются в экскретируемых белках или белках плазматической мембраны.Напротив, цитозольные белки часто лишены дисульфидных связей. Известно, что цитозольные цистеины поддерживаются в тиольной форме системами глутаредоксина и тиоредоксина, и по этой причине нехватка дисульфидных мостиков в цитозольных белках может приводить или не приводить к снижению содержания цистеина в белках. Однако одна из гипотетических причин повышенного количества цистеина в белках эукариот, особенно у млекопитающих, может заключаться в том, что сложные организмы могут содержать более широкий спектр внеклеточных белков, богатых цистеином.Поэтому мы изучили, содержат ли известные рибосомные белки млекопитающих больше цистеина, чем белки менее развитых организмов. Похоже, что рибосомные белки содержат меньше остатков цистеина у людей, плодовых мушек, дрожжей и E. coli по сравнению со средним содержанием цистеина в их белках (рис. 3). Это не относится к H. maresmortui. Однако общая тенденция, то есть менее развитые организмы, содержащие меньше остатков цистеина, остается в силе.

Мы также выбрали 10 рибосомных белков человека, для которых можно получить родственные последовательности для дрожжей, E.coli, и H. marismortui (таблица 1). Мы обнаружили, что объединенные 10 рибосомных белков человека содержат 2404 аминокислоты и 30 цистеинов среди них. Таким образом, их содержание цистеина составляло 1,25%, что значительно меньше, чем среднее содержание цистеина в человеческих белках (2,26%). Однако среднее содержание цистеина в их родственных рибосомных белках в дрожжах составляло 0,42%, за ними следовали E. coli с 0,19% и H. maresmortui с 0,11%. Поправка на содержание GC для различных видов существенно не повлияла на данные.Рибосомные белки, перечисленные в таблице 1, показали 60-78% идентичности / сходства между людьми и дрожжами (RL6 является исключением; он показывает незначительную идентичность / сходство между людьми и дрожжами). Несмотря на это, два из трех цистеинов были введены недавно в рибосомные белки человека.

Цистеины в белках человека были обнаружены вместо аланина ( n = 8), треонина ( n = 4), серина ( n = 4), валина ( n = 4), изолейцина ( n = 1), глицин ( n = 1,) и глутамин ( n = 1) в дрожжах.Часто эти замены обнаруживались в хорошо консервативных областях рибосомных белков.

В заключение, рибосомные белки относительно бедны цистеином, но общая взаимосвязь между их содержанием цистеина у различных видов (рис. 3) аналогична общей тенденции, показанной на рис. 1. Из этих данных видно, что эволюционная тенденция способствует включению большего количества остатков цистеина в белки более сложных организмов.

Содержание GC по сравнению с содержанием AU кодирующих ДНК и их связь с появлением цистеинов

Простейшим объяснением низкого содержания цистеина в белках у представителей Archea могло бы быть то, что содержание GC в ДНК коррелирует с наличием цистеина в белках различных видов.Поскольку многие представители Archea имеют ДНК с высоким содержанием GC, наличие аминокислот, которые кодируются триплетами, богатыми UA, не является предпочтительным. Однако цистеин может кодироваться триплетами UGU и UGC соответственно. Можно обнаружить сильную предвзятость в пользу использования C, а не U в позиции третьего кодона для кодирования цистеина у представителей Archea и других видов, богатых GC (данные не показаны). Поскольку двумя важными кодонами для цистеина являются U и G, содержание GC в первых двух положениях кодона было использовано для корректировки наших данных, как описано в «Материалы и методы».

Кроме того, мы изучили, следуют ли вхождения других аминокислот, кодируемых UA- или GC-богатыми триплетами, тенденциям, аналогичным таковому для цистеина у различных видов. Таблица 2 показывает, что ни фенилаланин (кодоны UUU и UUC), ни тирозин (UAU и UAC), ни изолейцин (AUU, AUC и AUA) не следуют тенденциям, аналогичным тенденциям цистеина среди изученных видов. То же самое верно и для других аминокислот (данные не показаны).

Неслучайное присутствие остатков цистеина в белках разных видов

Затем мы исследовали некоторые аспекты пространственного распределения цистеинов в белках различных видов.Чтобы ответить на вопрос, существуют ли какие-либо предпочтительные положения двух цистеинов относительно друг друга, мы провели системный поиск в репрезентативных файлах данных о белках различных видов. В качестве зонда применялась поисковая строка C- (X) _n -C. Здесь X обозначает любую аминокислоту, тогда как n — целое число от 0 до 22. Поскольку файлы данных для разных видов были очень разного размера, числа, представляющие появление C- (X) _n Последовательности -C в диапазоне n = 0–22 были усреднены и считались 1 для каждого вида.

На рис. 4 показано наличие последовательностей C- (X) _n -C у различных видов в диапазоне n = 0–8. Мы обнаружили, что последовательность C- (X) ₂ -C чаще встречается у всех исследованных видов, кроме растений. Таким образом, человеческие последовательности (другие млекопитающие демонстрируют аналогичные паттерны) содержат более чем в 1,5 раза больше мотивов C- (X) ₂ -C, чем мотивов C-X-C или C- (X) ₃ -C. По сути, такая же картина наблюдалась в D.melanogaster и C. elegans. Примерно каждый пятый белок содержал одну или несколько последовательностей C- (X) ₂ -C у этих видов (555 из 2681 белка человека и 131 из 624 белков плодовой мухи). Интересно, что белки растений не содержали выдающегося количества последовательностей C- (X) ₂ -C, как показано на примере кукурузы. Чтобы выяснить, все ли растения похожи на кукурузу, мы также изучили белки пшеницы, риса и томатов. Мы нашли аналогичные результаты (данные не показаны), подтверждающие, что растительные белки не имеют высокой репрезентативности последовательностей C- (X) ₂ -C.Однако белки хлоропластов различных растений демонстрируют паттерны C- (X) ₂ -C, аналогичные паттернам бактерий (данные не показаны).

Свободноживущий организм S. cerevisiae, , который имеет низкое содержание цистеина по сравнению с людьми (рис. 1), имеет более 5% от общего содержания цистеина, расположенного в мотивах C- (X) ₂ -C .

Относительное количество мотивов C- (X) ₂ -C было дополнительно увеличено у E. coli и других эубактерий, но наиболее заметное увеличение было у представителей Archea. Из 1063 цистеинов, обнаруженных в 553 известных белках, 232 остатка цистеина были обнаружены в мотивах C- (X) ₂ -C. Таким образом, более 21% цистеинов расположены по этой конкретной схеме.

Чтобы выяснить, расположена ли какая-либо другая аминокислота по схеме, подобной структуре цистеина, мы исследовали другие 19 аминокислот в файлах данных S. cerevisiae и E. coli . Наши результаты показали, что ни одна другая аминокислота не показала распределение, подобное цистеину, в белках S.cerevisiae или E. coli (данные не показаны).

Затем мы проанализировали различные мотивы C- (X) ₂ -C у людей, дрожжей, E. coli, и представителей Archea. Как и ожидалось, некоторые мотивы C- (X) ₂ -C были более многочисленными, чем другие. У людей вместо X имеется много остатков глутаминовой кислоты (и других заряженных аминокислот). Белки цинковых пальцев, металлотионены и дегидрогеназы могут содержать несколько из этих мотивов. Однако 555 из 2681 исследованных белков человека содержат по крайней мере один мотив C- (X) ₂ -C, и подробное описание и обсуждение их возможной взаимосвязи и сходства с их братьями и сестрами выходит за рамки настоящего отчета.Здесь достаточно заявить, что любая возможная комбинация аминокислот была найдена хотя бы один раз. Кроме того, наиболее распространенные мотивы C- (X) ₂ -C в файлах данных людей, дрожжей, E. coli, и Archea отличаются, хотя некоторые характерные композиционные особенности определенно присутствуют. Одним из таких случаев является отмеченное предпочтительное наличие полярных заряженных аминокислот у млекопитающих. Дрожжи, E. coli, и Archea , по-видимому, также содержат ряд остатков C-P-X-C или C-X-P-C.

Обсуждение

Цистеин — единственная кодируемая аминокислота, которая несет реактивную сульфгидрильную группу. Образуя внутри- и межцепочечные дисульфидные связи, он играет особую роль в структуре белка (Noiva 1994; Raina and Missiakas 1997). По-видимому, не менее важно, чтобы большинство цистеинов цитозольных белков поддерживалось в восстановленной тиоловой форме (Derman et al. 1993).

В данной работе мы изучали наличие цистеина у разных видов.Мы обнаружили, что представление цистеина в различных организмах имеет одну общую черту: цистеин недостаточно представлен в белках всех исследованных видов (рис. 1). Однако содержание цистеина в белках разных видов может составлять всего 0,4–0,5% в Archea, , тогда как белки млекопитающих обычно содержат около 2,26% остатков цистеина.

Более высокое содержание цистеина в белках более сложных организмов может быть частично объяснено большим количеством нецитозольных белков, богатых дисульфидными связями.Естественно, относительное отсутствие дисульфидных связей указывает, но не доказывает, что цитозольные белки относительно бедны цистеином. Тем не менее, наши результаты показывают, что рибосомные белки бедны цистеином по сравнению со средним содержанием цистеина в белках идентичных видов (рис. 3).

Однако увеличение содержания цистеина в белках сложных видов организмов справедливо и для рибосомных белков. Мы продемонстрировали, что родственные рибосомные белки имеют тенденцию включать больше цистеинов у более развитых видов (рис.3 и таблица 1). Например, несмотря на большое сходство между рибосомными белками человека и дрожжей, первый содержит почти в три раза больше остатков цистеина. Следовательно, нельзя не отметить взаимосвязь между повышенной сложностью и повышенным представлением цистеина (рис. 1).

Важно отметить, что эта тенденция уникальна для цистеина, поскольку другие аминокислоты не следуют той же тенденции. Мы объясняем описанные выше явления, предполагая, что эволюция использует преимущества более широкого использования цистеина.Уникальная способность цистеина формировать структуру белка, вероятно, чаще используется в развитых организмах.

Повышенное использование цистеина в развитых организмах может быть исследовано в свете теорий о распределении кодонов. Короче говоря, возможно, что даже примитивные древние организмы использовали кодовую таблицу, очень похожую на ту, что используется в современных организмах. В качестве альтернативы, древняя кодовая таблица могла кодировать менее 20 аминокислот, а нынешнее распределение кода может быть результатом прогрессивного деления кода (Wong 1975, 1976, 1988).Во время этого гипотетического процесса кодоны, назначенные данной аминокислоте, были общими с другими аминокислотами. Аргументы за и против этих теорий выходят за рамки настоящего отчета. С одной стороны, проблема с «теорией совместного использования кода» состоит в том, что новое распределение кодона — даже если заменяющая аминокислота является физико-химически родственным братом — вызовет широко распространенные структурные и функциональные изменения.

С другой стороны, тот факт, что некоторые организмы содержат «аномальное» распределение кода, поддерживает гипотезы эволюции кода и совместного использования кода (Osawa et al.1990, 1992; Джукс и Осава 1993). Кроме того, Doring и Marliere (1998) показали, что мутантные тРНК, которые включают цистеин в положениях, соответствующих изолейцину или метионину, могут сохраняться в E. coli. Токсичность неправильного кодирования цистеина была низкой, что доказывает, что цистеин является приемлемой заменой в большинстве положений белка.

Наши результаты показывают, что введение цистеина происходило постепенно в процессе эволюции (рис. 1), а прогрессирующие мутации привели к сдвигу в сторону увеличения использования цистеина.Следовательно, наше наблюдение не обеспечивает прямой поддержки совместного использования кодонов, но указывает на возможность того, что цистеин мог появиться «поздно» по сравнению с другими аминокислотами.

Мы также обнаружили своеобразную неслучайность в расположении цистеинов; а именно, два цистеина, разделенные двумя другими аминокислотами, встречаются с исключительно высокой частотой. Домен C- (X) ₂ -C чрезмерно представлен в белках ряда видов. Это чрезмерное представительство становится все более и более выраженным среди примитивных организмов, в результате чего более 21% общего количества цистеинов находится в пределах мотивов C- (X) ₂ -C у членов порядка Archea .

Наше объяснение этого феномена состоит в том, что первый и четвертый аминокислотные остатки в альфа-спирали или в конформациях бета-витка наиболее близки друг к другу, соответственно. Обнаружено, что аминокислоты, которые наиболее распространены в β-поворотах, относятся к четко определенной части генетического кода. Поскольку эта группа аминокислот содержит биосинтетические предшественники других аминокислот, возможно, что эти аминокислоты и β-повороты были более многочисленны на ранней стадии эволюции (Jurka and Smith 1987).

C- (X) ₂ -C мотивы являются важными доменами металлсвязывающих белков и оксидоредуктаз (Shuber et al. 1986; Ammendola et al. 1992). Каммак, Холл и Рао (1971) предположили, что ферредоксины играли важную роль в ранней эволюции.

Очень высокая распространенность мотивов C- (X) ₂ -C в примитивных организмах, вероятно, связана с относительной важностью короткодействующих взаимодействий внутриполипептидной цепи, в отличие от дальнодействующих взаимодействий внутриполипептидной цепи и интерполипептидной цепи. взаимодействия.В то время как первое было более важным для древних организмов, последние два типа взаимодействий становятся все более важными позже в эволюции. Это может объяснить наблюдение, что увеличение содержания цистеина привело к относительному уменьшению количества цистеинов, присутствующих в мотивах C- (X) ₂ -C.

Несмотря на относительное уменьшение количества цистеинов в мотивах C- (X) ₂ -C, мы обнаружили 555 таких мотивов в 2681 изученном белке человека. Факторы транскрипции, подобные цинковому пальцу или цинковому пальцу, используются в ряде белков, появившихся в многоклеточных организмах.К ним относятся различные рецепторы гормонов. Следовательно, эволюция привела ко многим новым применениям белков с доменами C- (X) ₂ -C, но еще больше белков приобрели цистеины в различных других положениях.

Таблица 1 Цистеин в белках рибосом разных видов

Таблица 2 Встречаемость аминокислотных остатков Phe, Tyr, Ile и Cys в белках различных видов (%)

Таблица 2 Встречаемость аминокислотных остатков Phe, Tyr, Ile и Cys в белках различных видов (%) )

Рис.1. — Наличие цистеина в белках различных видов. Содержание цистеина выражается в процентах (ось Y). Сумма всех 20 кодированных аминокислот считалась 100%. Все данные были скорректированы на содержание ГХ по сравнению с содержанием АТ видов, как описано в «Материалы и методы». Поскольку цистеин имеет 2 кодона из 61 смыслового кодона, математическая вероятность появления цистеина составляет 3,28% (последний столбец). Диапазон скорректированных данных GC составляет 3,23–3,28% для различных видов

Рис.1. — Наличие цистеина в белках различных видов. Содержание цистеина выражается в процентах (ось Y). Сумма всех 20 кодированных аминокислот считалась 100%. Все данные были скорректированы на содержание ГХ по сравнению с содержанием АТ видов, как описано в «Материалы и методы». Поскольку цистеин имеет 2 кодона из 61 смыслового кодона, математическая вероятность появления цистеина составляет 3,28% (последний столбец). Диапазон скорректированных данных ГХ составляет 3,23–3,28% для различных видов

Рис.2. — Белки с по крайней мере одним остатком цистеина и без него у различных видов. Черная часть сложенного столбца представляет белки с цистеином, а белая часть представляет белки без единого остатка цистеина. Сумма всех проанализированных белков считалась 100% (ось Y).

Рис. 2. — Белки с по крайней мере одним остатком цистеина и без него у различных видов. Черная часть сложенного столбца представляет белки с цистеином, а белая часть представляет белки без единого остатка цистеина.Сумма всех проанализированных белков считалась 100% (ось Y)

.
Рис. 3. — Содержание цистеина в рибосомных белках (черные столбцы) различных видов. Также показано общее содержание цистеина в белках (пустые столбцы) различных видов. Содержание цистеина выражается в процентах от 20 кодированных аминокислот (ось Y). Данные скорректированы по ГХ.
Рис. 3. — Содержание цистеина в рибосомных белках (черные столбцы) различных видов. Также показано общее содержание цистеина в белках (пустые столбцы) различных видов.Содержание цистеина выражается в процентах от 20 кодированных аминокислот (ось Y). Данные скорректированы по GC
Рис. 4. — Относительное положение цистеинов (закрашенные квадраты) и глицинов (пустые квадраты) на участке аминокислот ≤8 ( n ≤ 8). Встречаемость остатков цистеина и глицина была проанализирована для n = 0–22, и средняя встречаемость рассматривалась как 1. Общие значения встречаемости составили 24 484 для человека, 7 475 для Drosophila, 877 для кукурузы, 9 602 для S.cerevisae, 4515 для E. coli, и 545 для H. maresmortui. Фактическое вхождение отображается на оси Y; n отображается по оси X. Данные скорректированы с помощью ГХ.
Рис. 4. Относительные положения цистеинов (закрашенные квадраты) и глицинов (пустые квадраты) на участке аминокислот ≤8 ( n ≤ 8). Встречаемость остатков цистеина и глицина анализировалась для n = 0–22, и средняя встречаемость принималась за 1.Общие значения встречаемости составили 24 484 для человека, 7 475 для Drosophila, 9000 6 877 для кукурузы, 9 602 для S. cerevisae, 4515 для E. coli, и 545 для H. maresmortui. Фактическое вхождение отображается на оси Y; n отображается по оси X. Данные скорректированы по GC
Мы благодарим докторов наук. Дэвида М. Бедвелла, Миклоша Келлермайера, Иштвана Саймона и Дениса Н. Уитли за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Андраша Раба за техническую помощь.Работа поддержана грантом Министерства здравоохранения Венгрии (T-04 035/99).
цитированная литература
Аммендола С., К. А. Райя, К. Карузо, Л. Камарделла, С. Д’Аурия, М. Де Роса и М. Росси.
1992
. Термостабильная НАД (+) — зависимая алкогольдегидрогеназа из Sulfolobus solfataricus: определение последовательности генов и белков и связь с другими алкогольдегидрогеназами. Биохимия 31 : 12514–12523.
Baumann, U., и Дж. Оро.
1993
. Три этапа эволюции генетического кода. Биосистемы 29 : 133–141.
Каммак Р., Д. Холл и К. Рао.
1971
. Ферредоксины: это живые окаменелости? New Sci. 23 : 696–698.
Дерман, А. И., В. А. Принц, Д. Белин и Дж. Беквит.
1993
. Мутации, которые позволяют образовывать дисульфидные связи в цитоплазме Escherichia coli. Наука 262 : 1744–1747.
Доринг В. и П.Марлиер.
1998
. Термостабильная НАД (+) — зависимая алкогольдегидрогеназа из Sulfolobus solfataricus : определение последовательности гена и белка и связь с другими алкогольдегидрогеназами. Генетика 150 : 543–551.
Фэн Д. Ф., М. С. Джонсон и Р. Ф. Дулиттл.
1984
. Прогрессивное выравнивание аминокислотных последовательностей и построение из них филогенетических деревьев.
J. Mol. Evol.
21
:
112
–125.
Джукс, Т. Х. и С. Осава.
1993
. Эволюционные изменения генетического кода.
Сост. Biochem. Physiol. B Комп. Biochem.
106
:
489
–494.
Юнгк, Дж. Р.
1978
. Генетический код как периодическая таблица.
J. Mol. Evol.
2
:
211
–224.
Юрка Дж. И Т. Ф. Смит.
1987
. β превращается в раннюю эволюцию: хиральность, генетический код и биосинтетические пути. Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии.Vol. LII. Симпозиум Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.
Лоферер, Х. и Х. Хеннеке.
1994
. Белковые дисульфид оксидоредуктазы у бактерий.
Trends Biochem. Sci.
19
:
169
–171.
Мисета, А.
1989
. Роль молекул-предшественников аминокислот, связанных с белками, в организации генетических кодонов.
Physiol. Chem. Phys.
21
:
237
–242.
Майерс, Э.W. и W. Miller.
1988
. Оптимальные выравнивания в линейном пространстве.
Comput. Прил. Biosci.
4
:
11
–17.
Нойва, р.
1994
. Ферментативный катализ образования дисульфидов.
Protein Expr. Purif.
5
:
1
–13.
Осава, С., Т. Х. Джукс, К. Ватанабэ и А. Муто.
1992
. Недавние доказательства эволюции генетического кода.
Microbiol. Ред.
56
:
229
–264.
Осава, С., А. Муто, Т. Х. Джукс и Т. Охама.
1990
. Эволюционные изменения генетического кода.
Proc. R. Soc. Лондон. B Biol. Sci.
241
:
19
–28.
Райна С. и Д. Миссиакас.
1997
. Образование и разрыв дисульфидных связей.
Annu. Rev. Microbiol.
51
:
179
–202.
Шубер, А. П., Э. К. Орр, М. А. Рекни, П. Ф. Шендель, Х. Д. Мэй, Н. Л. Шауэр и Дж. Г. Ферри.
1986
.Клонирование, экспрессия и нуклеотидная последовательность генов формиатдегидрогеназы из methanobacterium formicicum.
J. Biol. Chem.
261
:
12942
–12947.
Стюарт, Э. Дж., Ф. Ослунд и Дж. Беквит.
1998
. Образование дисульфидной связи в цитоплазме Escherichia coli: изменение роли тиоредоксинов in vivo.
EMBO J.
17
:
5543
–5550.
Вебер, А. Л. и Дж. К. Лейси.
1978
. Корреляции генетического кода: аминокислоты и их антикодоновые нуклеотиды.
J. Mol. Evol.
2
:
199
–210.
Вёзе, К. Р. и Р. Гупта.
1981
. Архебактерии просто производные от «прокариот»? Природа 289 : 95–96.
Вёзе, К. Р., О. Кандлер и М. Л. Уилис.
1990
. К естественной системе организмов: предложение о доменах Archaea, Bacteria и Eucarya. Proc. Natl. Акад. Sci. США 87 : 4576–4579.
Вонг, Дж. Т. Ф.
1975
. Коэволюционная теория генетического кода.Proc. Natl. Акад. Sci. США 72 : 1909–1912.
———.
1976
. Эволюция универсального генетического кода. Proc. Natl. Акад. Sci. США 73 : 2336–2340.
———.
1988
. Эволюция генетического кода.
Microbiol. Sci.
5
:
174
–181.
Чжун Л., Э. С. Арн-Эр, Дж. Люнг, Ф. Ослунд и А. Холмгрен.
1998
. Тиоредоксинредуктаза крысы и теленка гомологична глутатионредуктазе с удлинением на карбоксильном конце, содержащим консервативный каталитически активный предпоследний остаток селеноцистеина.
J. Biol. Chem.
273
:
8581
–8591.
Реконструкция биосинтеза цистеина с использованием сконструированных безцистеиновых ферментов
Дизайн генов для безцистеиновых генов
cysE и cysM
E. coli K-12 субшрейн MG1655 cysE (ID Gen8153 cysE ) Гены cysM (Genbank ID: 732683705) были отобраны для создания синтетических белковых продуктов без какого-либо цистеина.Последовательности генов модифицировали с помощью программного обеспечения Geneious 8.0. Кодоны, соответствующие остаткам цистеина CysE и CysM, были заменены кодонами серина в последовательности гена. Таким образом, чтобы создать ген cysE-C , всего три остатка цистеина, расположенные на аминокислотных остатках 3, 23 и 83, были заменены серином, чтобы создать ген cysE-C . Аналогичным образом, всего два остатка цистеина, расположенные на аминокислотных остатках 252 и 280, были заменены серином для cysM-C .Все разработанные гены были предоставлены компанией Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова, США) и оптимизированы по кодонам с использованием их онлайн-сервиса для достижения эффективной экспрессии в E. coli .
Дизайн для генов без цистеина и с дефицитом метионина
cysE и cysM
Ферменты без цистеина и метионина были созданы на основе последовательностей генов cysE-C и cysM-C . Кодоны остатков метионина были заменены на кодоны лейцина или изолейцина.Ген cysE-CM был создан путем замены кодонов метионина кодоном лейцина во всех восьми остатках (26, 48, 58, 77, 155, 201, 254 и 256) генной конструкции cysE-C . Аналогичным образом ген cysM-CM был создан путем замены восьми кодонов метионина гена cysM-C лейцином (остатки 19, 48, 78, 103, 119, 173, 186 и 241) и трех кодонов метионина на для изолейцина (87, 95 и 129). Все разработанные гены были предоставлены компанией Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова, США) и оптимизированы по кодонам с использованием их онлайн-сервиса для достижения эффективной экспрессии в E.coli .
Визуализация структур белков CysE и CysM
CysE (EC2.3.1.30), белок из 273 аминокислот, организован в виде димера слабо уложенных тримеров для выполнения функции серинацетилтрансферазы ²⁶. CysM (EC2.5.1.47) представляет собой белок из 303 аминокислот, который существует в виде димера и является одним из двух изоферментов, которые катализируют вторую стадию синтеза цистеина ²². Кристаллические структуры CysE (PDB ID: 1T3D) и CysM (PDB ID: 2BHS) были получены из банка данных белков RSCB.Файлы PDB были импортированы в PyMOL версии 1.6.0.0 (Шредингер, Нью-Йорк). Были идентифицированы остатки, участвующие в создании кармана активного центра (каталитическое ядро и распознавание субстрата). Остатки активного центра составляют 92, 143, 157–158, 178, 184–185, 192, 204, 222 и 235 для CysE ^{, 27,} и 41, 68–72, 95, 119, 140, 141, 174, 175, 208. –210 и 212 для CysM ²². В дополнение к моделированию мы выполнили поиск гомологии путем итеративного сравнения HMM-HMM с использованием HHblits Release-2.18.2 (Тюбинген, Германия) на нативных аминокислотных последовательностях E. coli CysE и CysM. Множественное выравнивание последовательностей было выполнено со следующими настройками: формат выравнивания FASTA, доля пробелов <50%, база данных uniprot20_Mar12 HMM, 1 максимальная итерация, режим глобального выравнивания, повторное выравнивание с проверенным MAC и порог корректировки MAC 0,0.
Синтез, клонирование и трансформация гена
Пять различных генных конструкций были синтезированы с использованием технологии gBlocks Gene Fragments (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA USA).Генные конструкции представляют собой cysE-C ( cysE с замененным цистеином), cysE-CM ( cysE с замененными цистеином и метионином), cysM (кодон-оптимизированный ген cysM cys), C ( cysM с замененным цистеином) и cysM-CM ( cysM с замененным цистеином и метионином). Для каждой генной конструкции мы добавили последовательности, содержащие сайты рестрикции HindIII и XhoI на 5′- и 3′-концах. ПЦР-амплификацию генной конструкции проводили с использованием Q5 High-Fidelity Master Mix (New England Biolabs Inc., Ипсвич, Массачусетс, США) с использованием праймера прямой метки (5′-GCTTGCATCGTACGTATCGG-3 ‘) и праймера обратной метки (5′-AGACGTAACGACCAACGCTAG-3’). Амплификацию выполняли в T100 Thermo Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США), используя 30-секундную начальную денатурацию при 98 ° C, 30 циклов 10-секундной денатурации при 98 ° C, 15-секундный отжиг при 60 ° C. ° C, удлинение на 30 с при 72 ° C и окончательное удлинение на 2 мин при 72 ° C. Продукты ПЦР очищали на колонке с использованием набора для очистки GenCatch PCR Cleanup Kit (Epoch Life Science., Sugar Land, TX, USA) и проверяли с помощью гель-электрофореза в 1% (мас. / Об.) Агарозном геле в 1x буфере TAE, прогон при 100 В в течение 30 минут. мин.Полученный гель окрашивали GelRed (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США).
Для клонирования и трансформации как продукты ПЦР, так и вектор pUC19 (New England Biolabs) расщепляли с использованием рестрикционных ферментов HindIII-HF и XhoI при 37 ° C в течение 1 ч в 1x буфере CutSmart (New England Biolabs). Затем переваренные продукты очищали от посторонней ДНК с использованием набора MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN, Germantown, MD). Пятьдесят нанограммов pUC19 и 50 нг расщепленных продуктов ПЦР, кодирующих генную конструкцию, смешивали со смесью ElectroLigase (New England Biolabs) в конечном объеме 20 мкл в 1х буфере для реакции ДНК-лигазы Т4 в течение 1 часа.Лигированные продукты трансформировали в 50 мкл электрокомпетентных клеток, используя Electroporator 2510 (Eppendorf, Hauppauge, NY, USA) с импульсом 1800 В. Клетки ресуспендировали в 500 мкл супероптимального бульона со средой катаболитного репрессора (SOC) (20 г триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl ₂ и 10 мМ MgSO. ₄ в 1 л деионизированной воды, доведенной до конечного pH 7,0), и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C перед посевом.
Ауксотрофный
E.coli
В данном исследовании мы использовали два цистеин-зависимых ауксотрофных штамма. ΔcysE K-12 E. coli , нокаут-штамм (JW3582), был предоставлен через внутреннюю коллекцию E. coli Keio Knockout Collection, которая представляет собой компиляцию E. coli K-12. штаммы с нокаутом гена с базовым генотипом BW25113: Δ (araD-araB) 567, lacZ4787 (del) :: rrnB-3, rph-1, Δ (rhaD-rhaB) 568, hsdR514, для всех несущественных генов ²⁰ . Поскольку две O-ацетилсеринсульфгидрилазы (CysK и CysM) присутствуют в E.coli K-12, и на основании описания в предыдущих отчетах ^28,29, что штамм с единичным нокаутом для обоих генов ( cysK и cysM ) образовывал колонии на минимальной среде без цистеина, мы дополнительно сконструировали ΔcysKΔcysM штамм с двойным нокаутом. Сначала маркер канамицина удаляли из нокаутного штамма ΔcysM (JW2414), а затем аллель ΔcysK :: Km вводили в полученный штамм посредством трансдукции P1.Были отобраны устойчивые к канамицину колонии, и штамм-мишень, лишенный генов cysK и cysM , был отобран с помощью ПЦР с использованием праймеров, специально разработанных для cysK (JW2407_cysK-up; CCAGTATTGCGATTACCCC и JW240TGTGyscc и JW2407_cysTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGS (JW2414_cysM-up; CGAGCGTTTATTCGTTGGTC и JW2414_cysM-down; TTATCCGGCCTACAAAATCG). Цистеин-зависимая ауксотрофия нового штамма с двойным нокаутом ΔcysKΔcysM была подтверждена на минимальной среде с глюкозой M9 + с цистеином и без него (рис.4).
Подготовка электрокомпетентных клеток
По одной колонии, каждая из E. coli ΔcysE и ΔcysKΔcysM мутантов отбирали из свежего планшета LB + Kan и инокулировали в 10 мл среды 2xYT (16 г казеинового гидролизата, 10 г дрожжей. экстракт и 5 г NaCl на 1 л деионизированной воды, доведенной до конечного pH 7,0), и выращивали в течение ночи при 37 ° C в качестве заквасочной культуры. Ночную культуру инокулировали в 1 л среды 2xYT и инкубировали при 37 ° C, энергично встряхивая, до достижения OD ₆₀₀, равного 0.6. Затем культуру помещали на лед и центрифугировали при 4 ° C и 2500 × g в течение 25 мин. Клетки дважды промывали 800 мл деионизированной воды при 4 ° C. Затем культуру ресуспендировали в 80 мл 10% глицерина при 4 ° C и осаждали при 4000 × g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатант удаляли и к клеткам добавляли 2 мл 10% глицерина при 4 ° C. Для хранения клетки распределяли по аликвотам по 100 мкл, быстро замораживали в жидкости N ₂ и хранили при -80 ° C для будущего использования.
Функциональный скрининг ферментативной функции биосинтеза цистеина
Векторы pUC19, содержащие гена cysE-C или cysE-CM , трансформировали в электрокомпетентные клетки ΔcysE , а векторы с cysM3154 cysM-90 Гены -CM трансформировали в электрокомпетентные клетки ΔcysKΔcysM .Один микролитр ДНК добавляли к 79 мкл клеток, размороженных на льду, и смесь инкубировали при 4 ° C в течение 10 мин. Затем клетки подвергали электропорации при импульсе 1800 В с использованием Electroporator 2510 (Eppendorf) с последующей инкубацией в 0,5 мл среды SOC при 37 ° C в течение 15 минут. После инкубации добавляли 0,5 мкл 0,4 М IPTG, и культуре позволяли инкубироваться в течение дополнительных 30 мин. Затем клетки осаждали при 7500 × g в течение 90 секунд, промывали 500 мкл минимальной среды M9 + глюкозы, снова осаждали и ресуспендировали в глюкозе M9 + с 0.4 мМ IPTG. Затем трансформированные клетки высевали на минимальную среду M9 + глюкозы с добавлением 0,4 мМ IPTG, 50 мкг / мл канамицина и 100 мкг / мл ампициллина (M9 + глюкоза + Amp + Kan + IPTG).
Чашки инкубировали при 30 ° C в течение одной недели (168 ч) или до образования колоний, в зависимости от того, что происходило раньше. Выделяли колонии, образовавшиеся на минимальной среде. Также были проведены два контрольных эксперимента: положительный контроль, состоящий из электрокомпетентных клеток ΔcysE , трансформированных cysE в векторе pUC19, а другой — электрокомпетентных клеток ΔcysKΔcysM , трансформированных оптимизированным по кодонам cysM в векторе pUC19.Клеткам давали инкубироваться при 30 ° C в течение ночи. Вторая группа положительного контроля восполнила недостаток цистеина путем выращивания нокаутных клеток с пустыми векторами pUC19 на полностью дополненной среде, LB + Amp, и им позволили инкубироваться при 37 ° C в течение ночи. Кроме того, отрицательные контроли, состоящие из электрокомпетентных клеток ΔcysE и ΔcysKΔcysM , трансформированных пустыми векторами экспрессии pUC19, высевали на минимальную среду M9 + глюкоза + Amp + Kan + IPTG и инкубировали при 30 ° C в течение 168 часов.
Колонии собирали и выращивали в течение ночи в жидких средах LB + Amp + Kan. Затем плазмиды из спасенных колоний очищали с использованием набора QIAGEN QIAprep Spin Miniprep Kit. Эти плазмиды секвенировали Elim Biopharmaceuticals, Inc. (Хейворд, Калифорния, США) с прямым праймером 5′-CACTCATTAGGCACCCCAGG-3 ‘и обратным праймером 5′-GAGACGGTCACAGCTTGTCT-3’. Чтобы подтвердить, что плазмиды были ответственны за спасение штаммов с нокаутом, выделенные плазмиды и были повторно трансформированы в соответствующие новые электрокомпетентные клетки с нокаутом.Клетки высевали на планшеты M9 + глюкоза + Amp + Kan + IPTG и инкубировали при 30 ° C в течение 168 часов или до образования колоний, в зависимости от того, что произойдет раньше.
Анализ кривой роста
Всего было получено восемь трансформантов: три варианта cysE (cysE, cysE-C и cysE-CM ) и пустая плазмида pUC19 были трансформированы в штамм ΔcysE и три варианта cysM ( cysM, cysM-C и cysM-CM ) и пустая плазмида pUC19 трансформировали в штамм ΔcysKΔcysM .Отдельные колонии выделяли из каждой чашки трансформантов и выращивали до 0,4–0,6 OD ₆₀₀ в LB + Amp + Kan при 37 ° C. Клетки осаждали при 7500 × g и трижды промывали 0,9% физиологическим раствором. Половину клеток ресуспендировали в LB + Amp + Kan, а другую половину клеток ресуспендировали в M9 + глюкоза + Amp + Kan. Исключая трансформанты с пустым вектором pUC19 (контроли), трижды повторяют 200 мкл культур каждого трансформанта в жидкости. LB + Amp + Kan + IPTG и M9 + глюкоза + Amp + Kan + IPTG на 0.05 OD ₆₀₀ добавляли в 96-луночный планшет соответственно. Две 200 мкл культуры ΔcysE и ΔcysKΔcysM с пустыми векторами pUC19 и пустыми LB + Amp + Kan + IPTG, а также две 200 мкл холостых культур M9 + глюкоза + Amp + Kan + IPTG были также добавлены в 96-луночный планшет. пластина. Чтобы свести к минимуму конденсацию, крышку 96-луночного планшета покрывали Triton X-100, добавляя к крышке 3–4 мл 0,05% Triton X-100 в 20% этаноле и обеспечивая равномерное покрытие крышки. ³⁰.Затем раствор сливали через 30 с и крышке давали высохнуть на воздухе на вертикальной поверхности. Планшет накрыли, а затем поместили в считывающее устройство для микропланшетов SPECTRAmax Plus384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), и OD ₆₀₀ отбирали на 48 часов каждые 10 минут. Чтобы представить переход от лаг-фазы к логарифмической (экспоненциальной) фазе, конкретная скорость роста E. coli μ была рассчитана на основе разницы между пятью последовательными измерениями OD ₆₀₀, где μ = Δln OD ₆₀₀ / Δt .Лог-фаза определялась периодом времени, в течение которого μ составляет ≥50% от максимального значения μ (μ _max), наблюдаемого для этой культуры (дополнительный рисунок S5).
Клонирование и очистка рекомбинантных белков
Семь новых генных конструкций ( cysE, cysE-C и cysE-CM , cysM, cysM-C, cysM-CM и cysM-CM2 -tag) в их протеин С-концевой области были разработаны и синтезированы с помощью технологии фрагментов генов gBlocks. cysM-CM2 представляет собой CysM-C с двумя заменами метионина M95I и M119L. Синтезированные генные конструкции сначала амплифицировали с помощью ПЦР и субклонировали в плазмиду pUC19 для проверки последовательности. Моноклональные гены дополнительно амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор pCR-Blunt II-TOPO с использованием набора для клонирования Zero blunt PCR (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), трансформировали в компетентные клетки One Shot BL21 Star (DE3) pLysS ( Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США) и высевали на чашки для образования колоний.Для каждой трансформированной генной конструкции случайным образом выбирали пять колоний и использовали для инокуляции 4 мл жидкой прекультуры LB + Kan. После инкубации при встряхивании в течение ночи при 37 ° C каждую предварительную культуру добавляли к 100 мл свежей жидкости LB + Kan. Культуры инкубировали при 37 ° C в течение 5 часов с последующим добавлением IPTG и снижением температуры инкубации до 30 ° C. После дополнительных 15 часов инкубации осадок клеток собирали центрифугированием при 8000 об / мин и 4 ° C в течение 5 минут и замораживали при -80 ° C в течение не менее 30 минут.Лизат белка собирали лизисом осадка клеток посредством повторяющейся обработки ультразвуком (2 секунды × 200 раз), оставшуюся фракцию клеток осаждали центрифугированием и собирали супернатант. Рекомбинантные белки очищали с использованием магнитных шариков Anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich Corporation, Сент-Луис, Миссури, США) с элюированием с использованием пептида 1: 1 3x и 1x FLAG (Sigma-Aldrich Corporation, Сент-Луис, Миссури, США). ). Большую часть пептида FLAG удаляли с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-0,5 мл 30K (EMD Millipore Corporation, Биллерсиа, Массачусетс, США).Вся работа проводилась с образцами на льду или охлажденными до 4 ° C. Для проверки очищенные белки инкубировали с буфером для образцов 4X Bolt LDS в течение 10 минут при 70 ° C, затем разделяли с помощью SDS-PAGE в течение 40 минут при 170 В с использованием геля Bolt 4–12% Bis-Tris Plus в 1X Bolt MES SDS Running. Буфер. Полосы визуализировали с помощью красителя SYPRO Orange Protein Gel Stain. Все наборы и расходные материалы, относящиеся к анализу SDS-PAGE, были получены через Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США.
Измерение активности CysE и CysM
Активность CysE измеряли как функцию превращения ацетил-КоА в КоА с помощью спектрофотометрического анализа с использованием реагента Эллмана ³¹.Ферментативные реакции готовили в 96-луночном планшете объемом 50 мкл, содержащем 50 мМ Трис-HCl pH 7,5, 5 мМ хлорид магния, 0,4 мМ ацетил-КоА и 2 мМ L-серин. Реакции инициировали добавлением 37 нг очищенного белка CysE и инкубировали при 37 ° C в течение 5, 10, 15 или 20 минут. Реакции останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 6 М гидрохлорид гуанидина) в соответствующие моменты времени. После завершения всех реакций в каждую лунку добавляли 50 мкл реагента Эллмана и растворы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.Наконец, оптическую плотность измеряли при 405 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов SPECTRAmax Plus384.
Активность
CysM измеряли как функцию превращения O-ацетилсерина (OAS) в L-цистеин с помощью спектрофотометрического анализа нингидрина ³². Сначала исходные ферменты инкубировали с PLP-гидратом при 4 ° C в течение 4 часов. Тем временем был приготовлен свежий реагент 2 нингидрина. Ферментативные реакции готовили в 96-луночном планшете объемом 75 мкл, содержащем 50 мМ HEPES, 10 мМ OAS и 4 мМ сульфид натрия в воде.Реакционные смеси завершали добавлением фермента до конечной концентрации 5 нг / мкл и инициировали инкубированием при 37 ° C в течение 0, 2,5, 5, 7,5 и 10 минут. Реакции останавливали добавлением 15 мкл 20% (мас. / Об.) Трихлоруксусной кислоты в каждый момент времени. После завершения всех реакций в каждую лунку добавляли 10 мкл 100 мМ раствора DTT с 17 мМ NaOH и реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут для восстановления цистина до цистеина. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл уксусной кислоты и 100 мкл реагента 2 нингидрина.Планшет нагревали при 90 ° C в течение 10 минут и быстро охлаждали на льду в течение 2 минут. Из каждой лунки 90 мкл раствора переносили в соответствующую лунку свежего 96-луночного планшета. Наконец, к каждому продукту реакции в свежем планшете добавляли 105 мкл 95% этанола и измеряли оптическую плотность при 560 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов SPECTRAmax Plus384. Ферментативные активности (мкмоль / мин / мг) CysE и CysM были рассчитаны на основе линии регрессии, экстраполированной из измеренных точек данных (рис.6).
Доступность данных
Наборы данных, созданные во время и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.
Границы | Истощение запасов цистеина, ключевое действие, направленное на предотвращение гибели ферроптотических клеток в раковых клетках
Введение
С начала 20 века перепрограммирование клеточного метаболизма было признано одним из основных признаков онкогенеза (1), который имеет большой потенциал для противоракового лечения.Ключевыми признаками раковых клеток из-за их высокой пролиферативной природы являются повышенная скорость метаболизма, повышенное окислительное давление и, следовательно, зависимость от антиоксидантной защиты с точки зрения поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза. Центральная роль аминокислот в антиоксидантной защите в основном связана с участием серина, глутамина / глутамата и цистеина в производстве глутатиона (GSH) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) (2, 3). Одной из особенностей цистеина является его полусущественная природа и его роль в гомеостазе GSH.GSH является ключевым неферментативным игроком в клеточной антиоксидантной защите и широко вовлечен в инициацию, прогрессирование, метастазирование и резистентность опухоли. Таким образом, снабжение питательными веществами и окислительно-восстановительный баланс взаимосвязаны и имеют большое значение для лечения рака. В настоящем обзоре мы более подробно опишем роль цистеина в (пато) физиологии рака с двух сторон; цистеин как протеиногенная аминокислота и цистеин как аминокислота, участвующая в GSH- и, следовательно, в окислительно-восстановительном гомеостазе.
Цистеин, ключевой игрок в метаболизме опухолей
Цистеин — серосодержащая аминокислота. Несмотря на то, что она описана как «заменимая» аминокислота, в условиях высоких потребностей в питательных веществах она становится незаменимой. В печени особый метаболический путь, называемый транссульфурацией, позволяет поставлять цистеин путем преобразования незаменимой аминокислоты: метионина. Тем не менее, этого взаимного превращения аминокислот недостаточно для обеспечения потребности в цистеине быстро делящихся раковых клеток (4).Как упоминалось ранее, цистеин представляет собой тиолсодержащую аминокислоту, нуклеофильность которой делает ее очень чувствительной к окислительно-восстановительным изменениям. Примечательно, что впечатляющая сложность динамики цистеином отражает его важную роль в клетке. Действительно, цистеин играет решающую роль во многих процессах, таких как сборка, стабильность и транспортировка белков, биосинтез кофермента А и таурина, кластерный биогенез железо-сера (Fe-S), детоксикация тяжелых металлов и окислительно-восстановительный баланс (5). Ряд патологий характеризуется несбалансированным цистеиномным профилем, включая цистинурию, почечные камни, болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера (6–8).При раке влияние цистеина на образование, распространение и устойчивость опухолей широко описано (5).
Строительный блок для трех основных питательных веществ (углеводов, липидов и белков): простых сахаров, жирных кислот и аминокислот, поступающих с пищей. В отличие, например, от жирных кислот, аминокислоты из-за их липофобности требуют транспортеров для импорта / экспорта. К настоящему времени в клетках млекопитающих описано более 30 различных переносчиков аминокислот, однако небольшой, так называемый «минимальный набор» среди них постоянно сверхэкспрессируется во многих различных типах опухолей (9–11).Этими транспортерами являются LAT1, ASCT2 и система Xc ^—. Согласно нашему предыдущему исследованию, LAT1 (сокращение от L-type Amino acid Transporter 1) незаменим для транспорта незаменимых аминокислот, общего гомеостаза аминокислот и, следовательно, роста опухоли (12). ASCT2 или транспортер аланин-серин-цистеин 2 — это транспортер, который обменивает небольшие нейтральные аминокислоты и играет решающую роль в поглощении глутамина и стимулировании роста опухоли независимо от активности LAT1 (13).Третьим сверхэкспрессируемым переносчиком при раке является Xc-система, обменник, который импортирует цистин, окисленную форму цистеина, и экспортирует глутамат. Этот натрий-независимый антипортер состоит из двух субъединиц: xCT (имя гена SLC7A11 ), субъединицы, ответственной за аминокислотный обмен, и шаперона CD98 (имя гена SLC3A2 ). В 2011 году также было описано, что трансмембранный гликопротеин CD44, маркер раковых стволовых клеток, а точнее вариант CD44 (CD44 ^v), способный связывать гиалуронан, взаимодействует и стабилизирует Xc-систему (14) (Рисунок 1). .Хотя роль CD44 в транспортной активности xCT до сих пор не подтверждена, предполагается интересное участие в эндоцитозе железа через гиалуронаты, связанные с CD44, (15) (Рисунок 1). Наша группа недавно описала, что генетическое нарушение субъединицы xCT с использованием CRISPR-Cas9 ингибирует синтез и пролиферацию белка in vitro (16) и приводит к специфической неапоптотической гибели клеток, называемой ферроптозом, которая будет описана позже в этом обзоре. Анализ транспорта C-цистина ¹⁴ в нокаутных клетках xCT (xCT-KO) показал, что этот переносчик является уникальным и незаменимым для поглощения цистина, поскольку наблюдается полное прекращение транспорта цистина.Напротив, в анализе in vivo клеткам xCT-KO протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC), введенным подкожно, удалось сформировать опухоль, хотя и с короткой задержкой. Это указывает на то, что другие механизмы участвуют в поддержании внутриклеточного пула цистеина in vivo , обеспечивая рост опухоли. Действительно, одним из плохо обсуждаемых ограничений исследования транспорта цистина in vitro является тот факт, что обычно используемые питательные среды содержат исключительно окисленную форму цистеина.В соответствии с этим использование восстанавливающего источника, такого как β-меркаптоэтанол, позволяет обратить вспять фенотип xCT-KO, как сообщила пару десятилетий назад группа Bannai (17, 18). Следовательно, высокодинамичное соотношение пары цистин / цистеин in vivo может объяснить расхождение с фенотипом in vitro . Транспорт восстановленной формы цистеина был назначен переносчикам из семейства ASCT. Однако в случае ASCT2 исследования показали, что цистеин на самом деле является конкурентным ингибитором, а не субстратом для ASCT2 (19, 20).Точно так же предварительные результаты в нашей группе показывают, что ASCT2 не участвует в захвате цистеина выжившими клетками PDAC с двойным нокаутом xCT-ASCT2 в присутствии β-меркаптоэтанола. Наша лаборатория в настоящее время сосредоточена на изучении этой очень труднодостижимой транспортной системы для импорта цистеина.
Рисунок 1 . Обеспечение пула внутриклеточного цистеина. Внеклеточный окисленный цистин импортируется за счет одной молекулы глутамата через систему Xc ^—, состоящую из двух субъединиц: транспортера xCT и шаперона CD98.Этот комплекс xCT также связан с маркером стволовых раковых клеток CD44 _v. Затем импортированный цистин восстанавливается до цистеина цистинредуктазой (CR) (1). Конверсия метионина приводит к синтезу цистеина по пути транссульфурации (2). Двумя важными этапами в этом синтезе являются превращение гомоцистеина в цистатионин с помощью цистатионин-β-синтазы (CBS) и синтез цистеина из цистатионина с помощью цистатионазы (CTH). Распад глутатиона (GSH) через CHAC1 внутриклеточно обеспечивает поставку цистеина (3).GSH, либо из экзогенных источников, либо экспортированный из клеток через экспортер белка 1 множественной лекарственной устойчивости (MRP1), внеклеточно расщепляется γ-глутамилтрансферазой (GGT), образуя субстрат γ-глутамил-X и цистеинил-глицин. Этот дипептид цистеинил-глицина может либо потенциально транспортироваться через PEPT2, либо расщепляться дипептидазой, высвобождающей цистеин и глицин (5). Фрагмент γ-глутамила может образовывать комплекс с доступной внеклеточной цистой (е) с образованием γ-глутамилцистеина. Поставка цистеина из GSH является одной из основных функций γ-глутамил-цикла (4).Доступный внеклеточный цистеин затем транспортируется через членов семейства ASCT, но также может быть окислен и импортирован через xCT.
Высококонсервативная механистическая мишень рапамицина (mTOR) регулирует синтез, метаболизм и рост белка. Активация комплекса mTOR 1 (mTORC1) зависит не только от инсулина и факторов роста, активирующих соответственно PI3K и ERK1 / 2, но и от аминокислот. Действительно, транслокация mTORC1 из цитоплазмы в лизосому, богатый аминокислотами компартмент, является критическим для активации mTORC1 (21).Кроме того, хорошо описана специфическая активация mTORC1 аминокислотами глутамином, аргинином и лейцином (21, 22). Интересно, что недавнее сообщение предполагает, что цистеин per se также способен регулировать активность mTORC1 (23). В соответствии с этим нарушение захвата цистина ингибирует активацию mTORC1, что приводит к ингибированию синтеза белка (16, 24). Интересно отметить, что способность распознавать аминокислоты достигается с помощью различных механизмов, так что гомеостаз внутриклеточного синтеза белка обеспечивается с высокой точностью.За исключением mTORC1, другим важным путем в этом отношении является путь аминокислотного голодания. А именно, протеинкиназа General Control Nonderepressible (GCN2) представляет собой сенсор аминокислот, который активируется внутриклеточным накоплением незаряженной тРНК (25, 26). GCN2 подавляет общий синтез белка и активирует транскрипцию генов, участвующих в синтезе и транспорте аминокислот, посредством активации фактора транскрипции ATF4. Этот путь GCN2-ATF4 имеет решающее значение для выживания опухолевых клеток во время дефицита питательных веществ (27).Наши данные из клеточных линий PDAC показали, что генетическое устранение транспортера xCT приводит к внутриклеточной недостаточности цистеина и, следовательно, к активации пути GCN2-ATF4 (16). Результаты, описанные для клеток PDAC, также были подтверждены при раке груди человека после генетического или фармакологического ингибирования этого переносчика (28).
Вкратце, активация пути аминокислотного стресса GCN2-ATF4 и ингибирование синтеза белка посредством ингибирования mTORC1 демонстрируют сильную протеогенную роль цистеина в опухолевых клетках.Тем не менее, роль в построении белковых молекул — не единственная функция цистеина. Особенностью этой аминокислоты является ее бифункциональность, а ее другая важная роль заключается в создании клеточной антиоксидантной защиты посредством биосинтеза наиболее консервативного и широко распространенного неферментативного антиоксиданта в клетке: глутатиона.
Глутатион: гомеостаз и функции
Глутатион (GSH) является наиболее распространенным небелковым тиолом в клетках млекопитающих, достигая внутриклеточной концентрации в мМ диапазоне, тогда как его концентрация в плазме не превышает микромолярного диапазона.В клетке 90% GSH находится в цитоплазме, 10–12% в митохондриях и небольшой процент в эндоплазматическом ретикулуме (ER) (29). Этот небольшой трипептид состоит из глутамата, цистеина и глицина. Его биосинтез представляет собой двухэтапный ферментативный каскад, включающий сначала специфическое γ-лигирование глутамата и цистеина γ-глутамат-цистеинлигазой (GCL), а затем образование пептидной связи между этим дипептидом и глицином с помощью глутатионсинтетазы (GS). Фермент GCL состоит из двух субъединиц: тяжелой каталитической субъединицы GCLc и легкой регуляторной субъединицы GCLm.Доступность цистеина является ограничивающим фактором синтеза GSH из-за того, что GCLc Km для цистеина, около 270 мкМ, примерно равна его внутриклеточной концентрации. GSH участвует во многих важных клеточных функциях благодаря своей ключевой роли в антиоксидантной защите, защищая клетку от свободных радикалов, образующихся как побочные продукты метаболизма, прямо или косвенно. Многочисленные исследования показали, что эта небольшая молекула имеет решающее значение при многих различных заболеваниях человека, таких как старение, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), а также нейродегенеративные заболевания и заболевания печени (30).Важность глутатиона в метаболизме опухолей и особенно в механизмах резистентности широко изучалась в течение последних десятилетий. Одна из хорошо описанных ролей, которую играет GSH, — это детоксикация ксенобиотиков, таких как различные лекарства, и, таким образом, она имеет фундаментальное значение для устойчивости к химио-, а также лучевой терапии. Действительно, множественная лекарственная и радиационная устойчивость опухолевых клеток связана с более высокими внутриклеточными уровнями GSH, а повышенный уровень GSH является плохим прогностическим фактором при многих типах рака (31).
γ-глутаматильный цикл или цикл Мейстера, первоначально предложенный в 60-х годах, описал синтез и распад GSH, что сделало его сильным донором цистеина в физиологических и патологических условиях (32). Синтез цистеина через путь транссульфурации и биосинтез GSH происходит в основном в печени в физиологических условиях, в то время как при патологии другие клетки могут брать на себя ту же роль или вносить в нее свой вклад (будет рассмотрено далее в следующем абзаце). GSH, выделяемый в кровь, расщепляется на составляющие; и de novo . Синтез GSH раковыми клетками происходит следующим образом: GSH сначала экспортируется из исходной клетки через транспортеры , известные как лекарственные белки с множественной резистентностью (MRP), которые относятся к семейству транспортеров АТФ-связывающих кассет (ABC). и хорошо известен в механизмах устойчивости к раку (33).Затем, оказавшись во внеклеточном пространстве, GSH расщепляется γ-глутамил-трансферазой (GGT), которая также известна как фактор плохого прогноза для онкологических больных (34). Имея активный центр на внешней поверхности плазматической мембраны, GGT катализирует перенос γ-глутаматильной части от GSH к свободной аминокислоте и, таким образом, высвобождает дипептид цистеин-глицин, который может транспортироваться в его интактной форме через протон -связанный член семейства переносчиков олигопептидов PEPT2 (35, 36) или дополнительно расщепленный дипептидазами до цистеина и глицина.С другой стороны, γ-глутамил-аминокислоты превращаются в 5-оксопролин и соответствующую аминокислоту с помощью γ-глутамилциклотрансферазы. Одна интересная возможность заключается в том, что γ-глутамил может образовывать комплекс с доступной внеклеточной свободной цистой (e), импортированной в клетку и, как таковой, может служить субстратом для GS во время синтеза GSH (минуя реакцию GCL). В физиологических условиях окисленный GSH может рециклироваться внутриклеточно с помощью GSH-редуктазы (GR) с использованием НАДФН в качестве восстанавливающей силы. Однако в стрессовых условиях, вызывающих окислительные процессы, этой редуктазы, по-видимому, недостаточно, что подчеркивает важность этого γ-глутамильного цикла (37).Как описано Bannai, этот цикл рециркуляции обеспечивает клетки очень надежным источником цистеина и, следовательно, GSH. Следовательно, локализация GGT через мембрану позволяет напрямую поглощать внеклеточную восстановленную форму цистеина до его окисления (38). Однако остается неясным, может ли интактный GSH пересекать клеточную мембрану через конкретный переносчик (39). Ожидается, что дальнейшее исследование путей с участием GSH принесет важную информацию в понимание физиологии рака (патогенеза) (2).
Помимо ATF4, другим фактором транскрипции, который регулирует экспрессию xCT, является ядерный фактор, связанный с эритроидом 2, фактор 2 (NRF2) через элемент антиоксидантного ответа (ARE), присутствующий в промоторной области гена xCT (40, 41). Уровни GSH напрямую коррелируют с доступностью цистеина; следовательно, нарушение захвата цистеина, генетически или химически, эффективно снижает внутриклеточные уровни GSH (16, 42). Как описано ранее, GSH выполняет несколько ролей в клетке, и одна из них действует как кофактор фермента глутатионпероксидазы 4 (GPx4).Эта пероксидаза с селеноцистеином в ее активном центре превращает гидропероксиды липидов в липидные спирты, используя восстанавливающую способность GSH. Перекиси липидов могут производиться либо спонтанно, либо с помощью процессов, катализируемых ферментами. Свободнорадикальная цепная реакция происходит в среде с окислительной недостаточностью, где производство ROS преодолевает их удаление. В конкретном случае гибели клеток без цистеина перекисное окисление липидов приобретает характер цепной реакции из-за реакции Фентона с двухвалентным железом (Fe ²⁺).А именно, окислительно-восстановительно-активные металлы, такие как Fe ²⁺, реагируют с пероксидами, образуя высокоактивные гидроксильные радикалы (R-HO ^∙), которые в дальнейшем способствуют развитию реакции перекисного окисления (43). Ферроптоз, предложенный группой Стоквелла в 2012 году, обозначает специфическую неапоптотическую гибель клеток, вызванную таким накоплением перекиси липидов после лишения цистина (42). Нарушение захвата цистеина и коллапс внутриклеточного пула GSH вызывает ингибирование детоксицирующей активности GPx4 и чрезмерное накопление окислительно поврежденных липидов на мембране, хотя остается неясным, влияет ли это исключительно на плазматическую мембрану клетки или эффект также распространяется на органеллы. мембраны.В целом, различные пути, участвующие в гомеостазе GSH, указывают на сложную динамическую и быструю смену этого трипептида и дают ключи к потенциальным мишеням для стратегии, истощающей GSH и индуцирующей ферроптоз.
Цистеин, перекиси липидов и ферроптоз
Глутатион-зависимый ферроптоз
После характеристики ферроптоза в 2012 г. ось цистеин-GSH-GPx4 описывается как важный путь его регуляции и, таким образом, рассматривается как потенциальная терапевтическая мишень.До сих пор мощные генетические инструменты позволяли уточнить значение, применимость и потенциал переносчиков цистина в гибели ферроптотических клеток при PDAC и раке молочной железы (16, 28). С другой стороны, сейчас растет интерес к разработке специфических фармакологических ингибиторов xCT, которые подтвердят фундаментальные исследования в клинических условиях. Почти 20 лет назад высокий внеклеточный уровень глутамата был описан как ингибитор поглощения цистина и индуктор специфической гибели клеток, называемой окситозом (44).Действительно, в 1988 г. Bannai сообщил об импорте глутамина через ASCT2 и преобразовании в глутамат, который экспортируется в обмен на импорт цистина (1: 1) через xCT (45). Тем не менее, совсем недавно метаболомный анализ показывает важность поглощения глутамина ASCT2 и его превращения в продуцирующий ROS промежуточный метаболит α-кетоглутарат в качестве маркера чувствительности во время гибели клеток, ингибирующих сульфасалазин xCT, при карциноме плоскоклеточных клеток головы и шеи (46). Сообщалось также, что глутаминолиз повышает чувствительность клеток меланомы к ферроптозу (47).Следовательно, эти исследования предполагают, что экспрессия ASCT2 может быть маркером чувствительности к ферроптозу.
Высокая концентрация внеклеточного глутамата была одним из первых описанных ингибиторов xCT, но несколько лет спустя эрастин (обозначающий эрадикатор RAS и малые Т-антиген-экспрессирующие клетки) был идентифицирован группой Стоквелла в линиях раковых клеток с мутацией RAS как ингибитор xCT транспорт (42). Эрастин широко используется в исследованиях in vitro в качестве эффективного индуктора ферроптоза при многих различных типах рака, включая рак молочной железы, PDAC, лимфому, рак почек, мозга и яичников (48).В недавнем исследовании была описана новая форма эрастина, имидазолкетонэрастин (IKE), более метаболически стабильная, чем предыдущая форма (49). Другие небольшие соединения также описаны как индукторы ферроптоза, в том числе два одобренных FDA препарата, сульфасалазин, назначаемый при карциноме и фибросаркоме легкого (50, 51) и сорафениб (52). Однако наша команда обнаружила, что специфичность этих двух соединений к xCT была относительно низкой, поскольку добавление аналога цистеина N-ацетил-цистеина (NAC) не могло спасти клетки от гибели (16).Другой возможный способ вызвать истощение внутриклеточного цистеина был предложен группой Крамера с использованием системного истощения цистеина в плазме лейкозных мышей. Это было сделано с использованием сконструированного фермента циста (e) inase, что привело к подавлению роста опухоли в ксенотрансплантатах рака груди и простаты (53). Тем не менее, важно отметить, что недавнее превращение метионина в цистеин через путь транссульфурации является потенциальным механизмом резистентности в условиях истощения цистеина.Превращение гомоцистеина в цистатионин цистатионин-β-синтазой (CBS) описано как ключевой игрок в восстановлении внутриклеточного пула цистеина, поскольку снижение его экспрессии увеличивает чувствительность к ферроптозу в клетках рака яичников при лечении ластином (54). Последующая реакция, которая формирует цистатионин из цистатионина под действием цистатионазы (CTH), также недавно была описана как играющая ключевую роль в механизмах адаптации во время стресса, вызванного дефицитом цистеина, в широком спектре линий раковых клеток (55).Изучение молекулярных механизмов, участвующих в восстановлении внутриклеточного окислительно-восстановительного буфера цистеина, представляет большой интерес для понимания механизмов устойчивости к ферроптозу. Важность этого пути имеет решающее значение не только для ферроптоза, поскольку цистатионаза, как также описано, участвует в уклонении от старения в меланоцитах и клетках меланомы (56).
Однако другие системы, расположенные ниже по цепочке поглощения цистина, также могут играть важную роль. Например, GSH может быть истощен путем ингибирования его синтеза с помощью ингибитора GCL (бутионин сульфоксимин, BSO) (57) в условиях, которые поддерживают интактный внутриклеточный пул цистеина.Другая стратегия истощения GSH — увеличение его оттока. Группа Диксона продемонстрировала, что экспортер GSH MRP1 сенсибилизирует клетки, обработанные ластином HPA1, к ферроптозу и, соответственно, ингибирование MRP1 приводит к удержанию GSH и приводит к устойчивости к ферроптозу (58). Кроме того, еще одним недавно описанным игроком, участвующим в катаболизме GSH, является специфический цитоплазматический фермент, деградирующий GSH, CHAC1 (59). Интересно, что этот фермент усиливает ферроптоз, вызванный цистеиновым голоданием, за счет активации пути GCN2-eIF2α-ATF4 в тройных отрицательных клетках рака молочной железы человека (60).Участие CHAC1 в повышении чувствительности к ферроптозу было недавно подтверждено при лимфоме Беркитта во время ферроптоза, индуцированного артесунатом (61). Эти два механизма, участвующие в оттоке и внутриклеточной деградации GSH, могут представлять большой интерес для воздействия на клетки, устойчивые к ферроптозу.
Третьей основной мишенью является селенофермент GPx4. Различные ингибиторы GPx4 вызывают ферроптоз, такие как RLS3, FIN56 и ML210 (24), а в последнее время — резибуфугенин (62). «Персистирующие» клетки после химиотерапии, устойчивые к лечению лапатинибом при раке груди, меланомы, легких и яичников, были охарактеризованы как GPx4-зависимые (63).Таким образом, введение индукторов ферроптоза в лекарственные средства для лечения рака звучит как многообещающая стратегия, направленная на преодоление приобретенной устойчивости к другим лекарствам. Теоретически нацеливание на любой узел оси цистеин-GSH-GPx4 кажется достаточным для индукции ферроптоза. Важно отметить, что результаты, полученные на мышах с нокаутом, предполагают, что ингибирование xCT может иметь наименьший побочный эффект по сравнению с GPx4 и GCL (18, 64, 65). Действительно, мыши xCT ^{— / —} здоровы и плодовиты, несмотря на повышение концентрации цистина в плазме и снижение уровня GSH в плазме.Следовательно, разработка эффективного и специфического ингибитора xCT — это многообещающий шаг вперед в терапии рака.
Глутатион-независимый ферроптоз
Несмотря на то, что с самого начала описывался как главный фактор ингибирования ферроптоза, недавно было описано, что ось цистеин-GSH-GPx4 может быть, по крайней мере частично, необязательной. Недавний генетический скрининг генов, дополняющих потерю GPx4 в устойчивых клеточных линиях, выявил новых участников ингибирования ферроптоза.Специфическая оксидоредуктаза, ранее известная как митохондриальный фактор, индуцирующий апоптоз-2 (AIFM2), способная рециркулировать восстановленный убихинол (коэнзим Q ₁₀ H ₂) из убихинона за счет NAD (P) H, была обнаружена. представлен как потенциальный ингибитор ферроптоза из-за того, что его сверхэкспрессия дополняет потерю GPx4 в PFA1 и фибросаркоме человека (66, 67). Поэтому с тех пор эта оксидоредуктаза AIFM2 была переименована в белок-супрессор ферроптоза-1 (FSP1) (рис. 2).Эти компенсаторные механизмы зависят от пути НАД (Ф) Н-мевалоната, который синтезирует убихинол. Убихинол улавливает радикалы, подвергающиеся перекисному окислению липидов в мембране. Следовательно, открытие этого параллельного GSH-независимого механизма поглощения перекиси липидов представляет большой интерес для разработки потенциальных химиотерапевтических средств на основе ферроптоза. Наконец, липидный состав мембран и, что более важно, длинная полиненасыщенная жирная кислота (ПНЖК) играет ключевую роль в чувствительности к ферроптозу.Это обогащение мембран PUFA запускается специфическим ферментом длинноцепочечным членом 4 семейства длинноцепочечных ацил-CoA синтетаз (ACSL4). Интересно, что ACSL4 преимущественно экспрессировался в панели базальных клеточных линий рака молочной железы и предсказывал их чувствительность к ферроптозу (68).
Рисунок 2 . Глутатион-зависимая и независимая ось ферроптоза. Смерть ферроптозных клеток зависит от накопления перекисей липидов в мембране, что приводит к ее разрушению и пузырению клеток (фотография, показывающая клетки xCT-KO, умирающие в результате ферроптоза).GSH-зависимая ось следует за цистеин-зависимым импортом через xCT и синтез GSH. Некоторыми из известных на сегодняшний день ингибиторов xCT являются эрастин, имидазолкетонэрастин (IKE), высокий внеклеточный глутамат, а также сорафениб или сульфасалазин (SSZ). Цистеин является ограничивающим скорость компонентом синтеза GSH через глутамат-цистеинлигазу (GCL). Этот биосинтез GSH может подавляться бутионинсульфоксимином (BSO). GSH может быть восстановлен с помощью GSH-редуктазы (GR), а затем использован в качестве кофактора с помощью GSH-пероксидазы 4 (GPX4) для детоксикации пероксидов липидов.GPX4 может подавляться различными ингибиторами, такими как RSL3, ML210 и FIN56, для индукции ферроптоза. GSH-независимая ось следует за детоксикацией перекиси липидов убихинолом, что приводит к его окислению до убихинона. Белок-супрессор ферроптоза 1 (FSP1) отвечает за регенерацию убихинона в убихинол и может быть прерван «ингибитором FSP1» (iFSP1). Ацетил-КоА является предшественником убихинолового и мевалонатного пути. Цистеин потенциально участвует в синтезе убихинола через пантотенатный путь, который использует цистеин для синтеза ацетил-коА.Синтез пантотената подавляется ингибиторами пантотенаткиназы (PanKi).
Заключение и оставшиеся вопросы
В течение последнего десятилетия изучение ферроптоза с обоих аспектов: индукция и профилактика стало предметом интересов для множества различных патологий. Тем не менее, остается не обсуждавшимся вопрос о роли цистеина в ферроптозе независимо от синтеза GSH. Другими словами, насколько похожи фенотипы клеток с истощенным цистеином и клеток с истощенным GSH? Вызван ли ферроптоз исключительно чрезмерным накоплением перекиси липидов из-за истощения GSH и окислительного повреждения, или также самой недостаточностью цистеина? Чтобы исследовать роль этой аминокислоты, использовали меченый цистин, чтобы проследить его включение в клетки PDAC до и после обработки IKE.Как описано ранее, большая часть экзогенного цистина включается в GSH, но неожиданно оставшаяся часть включается в синтез кофермента А через пантотенатный путь (69). Коэнзим A является предшественником холестерина и коэнзимом Q10 (убихинолом), который является продуктом мевалонатного пути, но также играет ключевую роль в биосинтезе жирных кислот и β-окислении. Примечательно, что липидный обмен играет решающую роль в ферроптозе (70). Поэтому мы предполагаем дополнительную роль цистеина, независимую от синтеза GSH, в предотвращении ферроптоза.С другой стороны, ингибирование синтеза GSH с помощью BSO, независимо от пула цистеина, было неоднократно описано как индуцирующее ферроптоз (42). Напротив, многие недавние исследования изучали и демонстрировали влияние истощения GSH на индукцию апоптоза через истощение митохондриального пула GSH , приводящее к высвобождению цитохрома c, в сочетании с химиотерапией при раке груди и лейкемии, соответственно (71, 72) . Более того, GSH также участвует в других типах гибели клеток, таких как некроптоз, и для получения более подробной информации см. Обзор Lv (73).В соответствии с этим, еще один недавно описанный механизм, участвующий в устойчивости к истощению GSH, — это сверхэкспрессия деубиквитиназ, которые ингибируют деградацию белка после ER-стресса (74). Эта система, не зависящая от перекиси липидов и апоптотических митохондриальных дефектов, выявляет сложность путей гибели клеток, вызванных истощением GSH. Наша команда в настоящее время проверяет эту гипотезу, используя нокаутные клеточные линии, специфически дефицитные по синтезу GSH. В целом, несмотря на недавний прогресс в этой области, подробные механизмы ферроптоза все еще в значительной степени неизвестны, и в этой новой захватывающей области исследований еще предстоит провести значительный объем исследований.
Авторские взносы
BD написал этот обзор, а MV и JP его отредактировали.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
BD и MV основаны Научным центром Монако (CSM) и ассоциацией монако GEMLUC (Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le Cancer).
Список литературы
2. Толедано М.Б., Хуанг М.Е. Незавершенная загадка физиологических функций глутатиона, старой молекулы, которая до сих пор хранит множество загадок. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал . (2017) 27: 1127–9. DOI: 10.1089 / ars.2017.7230
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
3. Вучетич М., Кормераис Ю., Паркс С.К., Пуиссегур Дж. Центральная роль аминокислот в окислительно-восстановительном гомеостазе рака: уязвимые точки окислительно-восстановительного кода рака. Передний Oncol . (2017) 7: 319. DOI: 10.3389 / fonc.2017.00319
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
4. Пахарес М.А., Перес-Сала Д. Метаболизм серных аминокислот у млекопитающих: взаимосвязь между окислительно-восстановительной регуляцией, питанием, эпигенетикой и детоксикацией. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал . (2018) 29: 408–52. DOI: 10.1089 / ars.2017.7237
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
6. Сахота А., Тишфилд Дж. А., Гольдфарб Д. С., Уорд М. Д., Ху Л.Цистинурия: генетические аспекты, мышиные модели и новый подход к терапии. Мочекаменная болезнь . (2019) 47: 57–6. DOI: 10.1007 / s00240-018-1101-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
8. Гу Л., Робинсон РАН. Простой метод изотопной маркировки для изучения окисления цистеина при болезни Альцгеймера: избирательное диметилирование окисленным цистеином (OxcysDML). Анал Биоанал Химия . (2016) 408: 2993–3004. DOI: 10.1007 / s00216-016-9307-4
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
9.Kandasamy P, Gyimesi G, Kanai Y, Hediger MA. Пересмотр переносчиков аминокислот: новые взгляды на здоровье и болезни. Trends Biochem Sci . (2018) 43: 752–89. DOI: 10.1016 / j.tibs.2018.05.003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
10. Барретина Дж., Капонигро Дж., Странски Н., Венкатесан К., Марголин А.А., Ким С. и др. Энциклопедия линии раковых клеток позволяет прогнозировать чувствительность к противоопухолевым препаратам. Природа . (2012) 483: 603–7. DOI: 10.1038 / природа11003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
12. Кормераис Ю., Джулиано С., ЛеФлох Р., Фронт Б, Дуриво Дж., Тамбютт Э. и др. Генетическое нарушение многофункционального комплекса CD98 / LAT1 демонстрирует ключевую роль транспорта незаменимых аминокислот в контроле mTORC1 и роста опухоли. Cancer Res . (2016) 76: 4481–92. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-3376
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
13.Cormerais Y, Massard PA, Vucetic M, Giuliano S, Tambutté E, Durivault J, et al. Переносчик глутамина ASCT2 (SLC1A5) способствует росту опухоли независимо от переносчика аминокислот LAT1 (SLC7A5). Дж. Биол. Хим. . (2018) 293: 2877–87. DOI: 10.1074 / jbc.RA117.001342
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
14. Ишимото Т., Нагано О., Яэ Т., Тамада М., Мотохара Т., Осима Х. и др. Вариант CD44 регулирует окислительно-восстановительный статус в раковых клетках путем стабилизации субъединицы xCT системы xc- и тем самым способствует росту опухоли. Раковые клетки . (2011) 19: 387–400. DOI: 10.1016 / j.ccr.2011.01.038
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
15. Мюллер С., Синдикубвабо Ф., Каньеке Т., Лафон А., Версини А., Ломбард Б. и др. CD44 регулирует эпигенетическую пластичность, опосредуя эндоцитоз железа. bioRxiv [Препринт] (2019). DOI: 10.1101 / 693424
CrossRef Полный текст | Google Scholar
16. Дахер Б., Паркс С.К., Дуриволт Дж., Кормераис Й., Байдарджад Х., Тамбутте Э. и др.Генетическая абляция цистинового транспортера xCT в клетках PDAC ингибирует mTORC1, рост, выживание и образование опухолей через питательные вещества и окислительный стресс. Cancer Res . (2019) 79: 3877–90. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-18-3855
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
17. Сато Х., Курияма-Мацумура К., Сиоу RCM, Исии Т., Баннаи С., Манн Г.Е. Индукция транспорта цистина через систему xc– и поддержание внутриклеточных уровней глутатиона в ацинарных и островковых клеточных линиях поджелудочной железы. Biochim Biophys Acta . (1998) 1414: 85–94. DOI: 10.1016 / S0005-2736 (98) 00159-X
CrossRef Полный текст | Google Scholar
18. Сато Х., Шиия А., Кимата М., Маэбара К., Тамба М., Сакакура Ю. и др. Редокс-дисбаланс у мышей с дефицитом транспортера цистина / глутамата. Дж. Биол. Хим. . (2005) 280: 37423–9. DOI: 10.1074 / jbc.M506439200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
19. Utsunomiya-Tate N, Endou H, Kanai Y. Клонирование и функциональная характеристика системного ASC-подобного Na + -зависимого переносчика нейтральных аминокислот. Дж. Биол. Хим. . (1996) 271: 14883–90. DOI: 10.1074 / jbc.271.25.14883
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
20. Scalise M, Pochini L, Pingitore P, Hedfalk K, Indiveri C. Цистеин является не субстратом, а специфическим модулятором переносчика человеческого ASCT2 (SLC1A5). FEBS Lett . (2015) 589: 3617–23. DOI: 10.1016 / j.febslet.2015.10.011
CrossRef Полный текст | Google Scholar
23. Yu X, Long YC. Перекрестное взаимодействие между цистином и глутатионом имеет решающее значение для регуляции сигнальных путей аминокислот и ферроптоза. Научная репутация . (2016) 6: 30033. DOI: 10.1038 / srep30033
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
24. Stockwell BR, Friedmann Angeli JP, Bayir H, Bush AI, Conrad M, Dixon SJ, et al. Ферроптоз: регулируемое звено клеточной смерти, связывающее метаболизм, окислительно-восстановительную биологию и болезнь. Ячейка . (2017) 171: 273–85. DOI: 10.1016 / j.cell.2017.09.021
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
25. Маурин А.К., Жусс С., Авероус Дж., Парри Л., Брюа А., Шерасс Y и др.Киназа GCN2 изменяет пищевое поведение для поддержания гомеостаза аминокислот у всеядных животных. Ячейка Метаб . (2005) 1: 273–7. DOI: 10.1016 / j.cmet.2005.03.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
27. Е Дж, Куманова М., Харт Л.С., Слоан К., Чжан Х., Де Панис Д.Н. и др. Путь GCN2-ATF4 имеет решающее значение для выживания и пролиферации опухолевых клеток в ответ на недостаток питательных веществ. EMBO J . (2010) 29: 2082–96. DOI: 10.1038 / emboj.2010.81
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
28.Коблер Л., Чжан Х., Сури П., Парк С., Тиммерман Л.А. Ингибирование xCT повышает чувствительность опухолей к γ-излучению за счет восстановления глутатиона. Онкотоваргет . (2018) 9: 32280–97. DOI: 10.18632 / oncotarget.25794
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
29. Delaunay-Moisan A, Ponsero A, Toledano MB. Пересмотр функции глутатиона в окислительном сворачивании и секреции белков. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал . (2017) 27: 1178–99. DOI: 10.1089 / ars.2017.7148
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
30.Тески Г., Абрахем Р., Цао Р., Гюрджян К., Исламоглу Х., Лусеро М. и др. Глутатион как маркер болезней человека. Adv Clin Chem. (2018) 87141–59. DOI: 10.1016 / bs.acc.2018.07.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
32. Орловски М., Мейстер А. γ-глутамил-п-нитроанилид: новый удобный субстрат для определения и изучения активности l- и d-γ-глутамилтранспептидазы. Biochim Biophys Acta. (1963) 73: 679–81. DOI: 10.1016 / 0926-6569 (63)
-4
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
34.Pompella A, Corti A, Paolicchi A, Giommarelli C, Zunino F. γ-глутамилтрансфераза, окислительно-восстановительная регуляция и устойчивость к лекарствам от рака. Curr Opin Pharmacol. (2007) 7: 360–6. DOI: 10.1016 / j.coph.2007.04.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
35. Dringen R, Hamprecht B, Bröer S. Пептидный транспортер pept2 опосредует захват предшественника глутатиона cysgly в первичных культурах, богатых астроглией. Дж. Нейрохим . (2002) 71: 388–93. DOI: 10.1046 / j.1471-4159.1998.71010388.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
36. Фрей И.М., Рубио-Алиага И., Сиверт А., Зайлер Д., Дробышев А., Бекерс Дж. И др. Профилирование уровней мРНК, белка и метаболитов выявляет изменения в почечной обработке аминокислот и метаболизме глутатиона в почечной ткани мышей pept2 — / -. Physiol Genomics . (2007) 28: 301–10. DOI: 10.1152 / Physiolgenomics.00193.2006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
37.Ян М.С., Чан Х.В., Ю.Л. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы частично отвечает за определение восприимчивости клеток к окислительному стрессу. Токсикология . (2006) 226: 126–30. DOI: 10.1016 / j.tox.2006.06.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
40. Сасаки Х., Сато Х., Курияма-Мацумура К., Сато К., Маэбара К., Ван Х и др. Электрофильный ответ-опосредованная индукция экспрессии гена переносчика обмена цистина / глутамата. Дж. Биол. Хим. . (2002) 277: 44765–71. DOI: 10.1074 / jbc.M208704200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
41. Конрад М., Сато Х. Индуцируемый окислительным стрессом цистин / глутаматный антипортер, система x c -: поставщик цистина и не только. Аминокислоты . (2012) 42: 231–46. DOI: 10.1007 / s00726-011-0867-5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
42. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al.Ферроптоз: железозависимая форма неапоптотической гибели клеток. Ячейка . (2012) 149: 1060–72. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.03.042
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
44. Ширли Тан, BSP, Дэвид Шуберт, BSP, Памела Махер, BSP. Окситоз: новая форма запрограммированной гибели клеток. Курр Топ Мед Хим . (2001) 1: 497–506. DOI: 10.2174 / 1568026013394741
CrossRef Полный текст | Google Scholar
45. Баннаи С., Исии Т.Новая функция глутамина в культуре клеток: использование глутамина для поглощения цистина фибробластами человека. Дж. Клеточная физиология . (1988) 137: 360–6. DOI: 10.1002 / jcp.1041370221
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
46. Окадзаки С., Умене К., Ямасаки Дж., Суина К., Оцуки Ю., Йошикава М. и др. Гены, связанные с глутаминолизом, определяют чувствительность к xCT-направленной терапии плоскоклеточного рака головы и шеи. Раковые науки . (2019) 110: 3453–63.DOI: 10.1111 / cas.14182
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
47. Ло М., Ву Л., Чжан К., Ван Х, Чжан Т., Гутьеррес Л. и др. miR-137 регулирует ферроптоз, воздействуя на транспортер глутамина SLC1A5 в меланоме. Разница в гибели клеток . (2018) 25: 1457–72. DOI: 10.1038 / s41418-017-0053-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
49. Zhang Y, Tan H, Daniels JD, Zandkarimi F, Liu H, Brown LM, et al. Имидазол кетон, эрастин вызывает ферроптоз и замедляет рост опухоли на модели лимфомы мышей. Cell Chem Biol . (2019) 26: 623–33.e9. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2019.01.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
50. Джи Х, Цянь Дж., Рахман С.М.Дж., Сиска П.Дж., Цзоу Й., Харрис Б.К. и др. xCT (SLC7A11) -опосредованное метаболическое перепрограммирование способствует прогрессированию немелкоклеточного рака легкого. Онкоген . (2018) 37: 5007–19. DOI: 10.1038 / s41388-018-0307-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
51. Патель Д., Харкар П.С., Ганди Н.С., Каур Э., Датт С., Нандейв М.Новые аналоги сульфасалазина в качестве ингибиторов антипортера системы x c–: выводы из исследований молекулярного моделирования. Лекарство Дев Рез. . (2019) 80: 758–77. DOI: 10.1002 / ddr.21557
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
53. Крамер С.Л., Саха А., Лю Дж., Тади С., Тициани С., Ян В. и др. Системное истощение L-цист (e) ина цистой (e) inase увеличивает количество активных форм кислорода и подавляет рост опухоли. Нат Мед . (2017) 23: 120–7. DOI: 10,1038 / нм.4232
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
54. Лю Н., Линь X, Хуанг С. Активация пути обратной транссульфурации через NRF2 / CBS придает резистентность к ферроптозу, индуцированному эрастином. Бр. Дж. Рак . (2020) 122: 279–92. DOI: 10.1038 / s41416-019-0660-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
55. Чжу Дж., Бериса М., Шверер С., Цинь В., Кросс Дж. Р., Томпсон CB. Активность транссульфурации может поддерживать рост клеток при ограничении внеклеточного цистеина. Ячейка Метаб . (2019) 30: 865–76.e5. DOI: 10.1016 / j.cmet.2019.09.009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
56. Leikam C, Hufnagel A, Walz S, Kneitz S, Fekete A, Müller MJ, et al. Цистатионаза опосредует уклонение от старения в меланоцитах и клетках меланомы. Онкоген . (2014) 33: 771–82. DOI: 10.1038 / onc.2012.641
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
57. Гриффит О.В., Мейстер А. Сильное и специфическое ингибирование синтеза глутатиона бутионин сульфоксимином (S-н-бутилгомоцистеин сульфоксимин). Дж. Биол. Хим. . (1979) 254: 7558–60.
PubMed Аннотация | Google Scholar
58. Cao JY, Poddar A, Magtanong L, Lumb JH, Mileur TR, Reid MA и др. Полногеномный гаплоидный генетический скрининг выявляет регуляторы содержания глутатиона и чувствительности к ферроптозу. Сотовый представитель . (2019) 26: 1544–56.e8. DOI: 10.1016 / j.celrep.2019.01.043
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
60. Chen M-S, Wang S-F, Hsu C-Y, Yin P-H, Yeh T-S, Lee H-C и др.Расщепление глутатиона CHAC1 усиливает индуцированный цистиновым голоданием некроптоз и ферроптоз в тройных отрицательных клетках рака молочной железы человека через путь GCN2-eIF2α-ATF ₄. Онкотоваргет . (2017) 8: 114588–602. DOI: 10.18632 / oncotarget.23055
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
61. Ван Н, Цзэн Г-З, Инь Дж-Л, Биан З-Х. Артесунат активирует путь ATF4-CHOP-CHAC1 и влияет на ферроптоз при лимфоме Беркитта. Биохимия Биофиз Рес Коммуна .(2019) 519: 533–9. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2019.09.023
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
62. Шен Л., Ци В., Бай Дж, Цзо Ц., Бай Д., Гао В. и др. Резибуфогенин (RB) ингибировал рост клеток колоректального рака и онкогенез за счет запуска ферроптоза и продукции ROS, опосредованных инактивацией GPX4. Anat Rec. (2020). DOI: 10.1002 / ar.24378. [Epub перед печатью].
CrossRef Полный текст | Google Scholar
63. Хангауэр М.Дж., Вишванатан В.С., Райан М.Дж., Боле Д., Итон Дж. К., Матов А. и др.Устойчивые к лекарствам персистирующие раковые клетки уязвимы к ингибированию GPX4. Природа . (2017) 551: 247–50. DOI: 10.1038 / nature24297
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
64. Ю С.-Э, Чен Л., На Р, Лю И, Риос К., Ван Реммен Х. и др. Удаление Gpx4 у взрослых мышей приводит к летальному фенотипу, сопровождающемуся потерей нейронов в головном мозге. Свободный Радик Биол Мед . (2012) 52: 1820–7. DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2012.02.043
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
65.Далтон Т.П., Дитер М.З., Ян Й., Шерцер Х.Г., Неберт Д.В.. Нокаут гена каталитической субъединицы глутамат-цистеинлигазы (Gclc) мыши: эмбриональная летальность при гомозиготности и предложенная модель умеренного дефицита глутатиона при гетерозиготности. Биохимия Биофиз Рес Коммуна . (2000) 279: 324–9. DOI: 10.1006 / bbrc.2000.3930
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
66. Doll S, Freitas FP, Shah R, Aldrovandi M, da Silva MC, Ingold I., et al. FSP1 является глутатион-независимым супрессором ферроптоза. Природа . (2019) 575: 693–8. DOI: 10.1038 / s41586-019-1707-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
67. Берсукер К., Хендрикс Дж. М., Ли З., Магтанонг Л., Форд Б., Тан PH и др. CoQ-оксидоредуктаза FSP1 действует параллельно GPX4, подавляя ферроптоз. Природа . (2019) 575: 688–92. DOI: 10.1038 / s41586-019-1705-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
68. Кукла С., Пронет Б., Тюрина Ю.Ю., Панзилиус Э., Кобаяши С., Ингольд И. и др.ACSL4 определяет чувствительность к ферроптозу, формируя липидный состав клеток. Нат Хем Биол . (2017) 13: 91–8. DOI: 10.1038 / nchembio.2239
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
69. Бэджли М.А., Кремер Д.М., Маурер Х.С., Делджорно К.Э., Ли Х.-Дж., Пурохит В. и др. Истощение запасов цистеина вызывает ферроптоз опухоли поджелудочной железы у мышей. Наука . (2020) 368: 85–9. DOI: 10.1126 / science.aaw9872
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
71.Льюис-Вамби Дж. С., Ким Х. Р., Вамби С., Патель Р., Пайл Дж. Р., Кляйн-Сзанто А. Дж. И др. Бутионин сульфоксимин сенсибилизирует устойчивые к гормонам клетки рака молочной железы человека к эстроген-индуцированному апоптозу. Рак молочной железы Res . (2008) 10: R104. DOI: 10.1186 / bcr2208
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
72. Рамос А.М., Аллер П. Кверцетин снижает внутриклеточное содержание GSH и усиливает апоптотическое действие антилейкемического препарата триоксида мышьяка в клеточных линиях лейкемии человека. Биохим Фармакол . (2008) 75: 1912–23. DOI: 10.1016 / j.bcp.2008.02.007
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
73. Lv H, Zhen C, Liu J, Yang P, Hu L, Shang P. Раскрытие потенциальной роли глутатиона во множественных формах гибели клеток в терапии рака. Клеточный лонж с оксидной средойv . (2019) 2019: 3150145. DOI: 10.1155 / 2019/3150145
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
74. Харрис И.С., Эндресс Дж. Э., Колофф Дж. Л., Селфорс Л. М., Макбрайер С. К., Розенблют Дж. М. и др.Деубиквитиназы поддерживают гомеостаз белка и выживаемость раковых клеток при истощении глутатиона. Ячейка Метаб . (2019) 29: 1166–81.e6. DOI: 10.1016 / j.cmet.2019.01.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
новых доказательств: как аминокислота цистеин борется с болезнью Хантингтона
Изображение нейрона грызуна показано зеленым цветом.
Предоставлено: Джерри Шоу через Викимедиа.
Поделитесь быстрыми фактами
Природные антиоксиданты организма могут замедлить развитие болезни Хантингтона.- Нажмите, чтобы написать в Твиттере
«Порочный круг», который движет болезнью Хантингтона. — Нажмите, чтобы написать в Твиттере
Исследователи из Johns Hopkins Medicine сообщают, что они идентифицировали биохимический путь, связывающий окислительный стресс и аминокислотный цистеин при болезни Хантингтона. Результаты, описанные на прошлой неделе в выпуске Proceedings of the National Academy of Sciences, , обеспечивают механизм, посредством которого окислительный стресс специфически повреждает нервные клетки при болезни Хантингтона, наследственном и смертельном нейродегенеративном заболевании.
Поскольку дефицит цистеина и окислительный стресс были связаны с другими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, артрит, сердечно-сосудистые заболевания, СПИД и рак, исследователи говорят, что эти результаты могут облегчить терапевтические стратегии для многих серьезных состояний.
Исследователи Хуан Сбодио, доктор философии; Соломон Снайдер, доктор медицины, доктор наук; и Бинду Пол, доктор философии, из отделения нейробиологии им. Соломона Х. Снайдера Медицинской школы Университета Джона Хопкинса, говорят, что, хотя есть много способов, которыми человеческие клетки регулируют окислительный стресс, те, которые связаны с цистеином, играют центральную роль.«Если вы истощите запасы цистеина, вы повлияете на большую часть этой антиоксидантной защиты», — говорит Пол.
Предыдущие эксперименты исследователей на мышах, опубликованные в майском выпуске журнала Nature за 2014 год, показали, что белок, ответственный за производство цистеина, цистатионин гамма-лиаза (CSE), истощен по HD. При низком уровне аминокислот нормальные клетки активируют CSE, используя белок, называемый активирующим фактором транскрипции 4 (ATF4). ATF4 распознает последовательности ДНК, которые кодируют белки, участвующие в синтезе аминокислот, включая CSE, и приказывают клетке запустить линию производства цистеина для синтеза белка и генерации других защитных молекул, полученных из цистеина.В то время как клетки с дефицитом цистеина могут использовать альтернативные пути в течение короткого времени, такие клетки в конечном итоге подавляются окислением и умирают. В этом исследовании исследователи обнаружили, что ATF4 нарушается в клетках с болезнью Гентингтона, влияя на выработку цистеина.
Чтобы охарактеризовать этот путь, исследователи вырастили как здоровые контрольные клетки мозга, так и клетки мозга, полученные от мышей с болезнью Хантингтона в условиях низкого содержания цистеина. Они обнаружили, что, хотя здоровые клетки увеличивали активность ATF4 в условиях низкого содержания цистеина, они не могли обнаружить ATF4 в клетках мышей с болезнью Хантингтона.Этот эффект был уникальным для цистеина: когда исследователи выращивали клетки в условиях, лишенных других аминокислот, уровни ATF4 были нормальными как в контрольных, так и в клетках Хантингтона. «Это заинтриговало нас, и мы задались вопросом, повлияет ли повышенный окислительный стресс на реакцию ATF4 из-за роли цистеина в клеточной защите», — говорит Пол.
Чтобы проверить это, исследователи вызвали окислительный стресс в здоровых клетках, подвергнув их воздействию перекиси водорода, сильного окислителя, а затем прекратили поступление цистеина.В этих условиях экспрессия клетками ATF4 была значительно снижена. И наоборот, когда клетки Хантингтона выращивали в условиях с истощением цистеина, но с введением антиоксиданта, витамина С, клетки восстанавливали свою способность создавать ATF4 и вырабатывать собственный цистеин.
«Эти результаты указывают на порочный круг, в котором низкие уровни цистеина вызывают окислительный стресс, который приводит к снижению уровня цистеина, что приводит к усилению окислительного стресса и дальнейшему замедлению выработки цистеина», — говорит Сбодио.Предыдущие исследования исследователей показали, что добавление цистеина в рацион мышей с болезнью Гентингтона замедляет прогрессирование симптомов болезни. Настоящее исследование раскрывает механизмы, с помощью которых регулируется цистеин, и то, как окислительный стресс влияет на эту систему.
Пол и ее коллеги отмечают, что антиоксиданты уже давно считаются полезными для укрепления здоровья, но они предупреждают, что, хотя антиоксиданты могут смягчать симптомы заболевания в лаборатории, требуется гораздо больше информации о роли цистеина в организме, прежде чем исследователи смогут подтвердить его терапевтическую ценность.Фактически, исследователи отметили, что добавление слишком большого количества цистеина может быть вредным. Пол говорит, что при некоторых условиях могут быть преимущества, но люди должны «всегда консультироваться со своим врачом, прежде чем начинать принимать какие-либо добавки. Мы не хотим, чтобы пациенты занимались самолечением ».
Это исследование финансировалось за счет грантов Национального института психического здоровья (Mh28501) и Фонда CHDI.
Анализ триптофана, цистеина и цистина от AltaBioscience
Анализ аминокислот триптофана, цистеина и цистина
Триптофан и цистеин обычно содержатся в белках, а также могут быть включены в пептиды.Для анализа этих конкретных аминокислот в образцах AltaBioscience использует различные методы, которые позволяют нам точно определять количество Cys и Trp.
Для точного определения аминокислот триптофана, цистеина и цистина необходимо выполнять отдельные индивидуальные анализы. Без предварительной обработки или специального анализа восстановление этих аминокислот будет нарушено или полностью потеряно.
Во время стандартного анализа триптофан разрушается с помощью обычного кислотного гидролиза, но устойчив к щелочному гидролизу гидроксидом бария.Мы можем предоставить отдельную щелочную систему, которая гарантирует, что триптофан не разрушается и может быть точно определен количественно.
Цистеин также нестабилен при обычном кислотном гидролизе. Обычно это наблюдается как цистин, и его восстановление варьируется в стандартных условиях гидролиза. Тем не менее, окисление до цистеиновой кислоты с использованием пермуравьиной кислоты перед кислотным гидролизом дает очень хорошее извлечение и точное количественное определение Cys. Поскольку эта предварительная обработка может повлиять на восстановление других аминокислот в образце, мы должны провести этот тип анализа в дополнение к нашему стандартному циклу гидролиза.
Подводя итог, оба этих метода отрицательно влияют на извлечение других аминокислот, поэтому для количественного определения всех 20 аминокислот требуются три полностью отдельных анализа: кислотный гидролиз, щелочной гидролиз и кислотный гидролиз с окислением пермуравьиной кислоты.
Мы можем, , если известна пептидная последовательность , оценить значения Cys и Trp, но для точного определения нам необходимо выполнить отдельные анализы, как описано выше.
Структура триптофана, цистеина и цистина
Триптофан содержит α-аминогруппу, группу α-карбоновой кислоты и индол в боковой цепи, что делает его неполярной ароматической аминокислотой.Он необходим для человека, а это означает, что организм не может его синтезировать, и он должен быть получен с пищей, поскольку он важен для ряда метаболических функций. Следовательно, если для образца требуется анализ незаменимых аминокислот, необходимо провести общий анализ аминокислот и отдельный анализ триптофана в дополнение к анализу общих аминокислот.
Цистеин — незаменимая аминокислота для человека. Он важен для синтеза белка, включая синтез бета-кератина, основного белка в ногтях, коже и волосах, а также для выработки коллагена, а также для эластичности и текстуры кожи.Цистеин — уникальная аминокислота, поскольку в его боковой цепи есть очень реактивная сульфгидрильная группа, которая способна образовывать дисульфидные мостики. Дисульфидные мостики играют важную стабилизирующую роль во многих белковых структурах, образуя поперечные связи между различными участками полипептидных цепей. Если пептид для анализа содержит дисульфидный мостик, его необходимо обработать DTT перед отдельным анализом цистеина. Пожалуйста, свяжитесь с одним из наших технических экспертов для получения дополнительной информации.
Цистин — это окисленная димерная форма цистеина.Две молекулы цистеина соединяются дисульфидным мостиком с образованием цистина.
Для получения дополнительной информации о структуре триптофана и цистеина или анализе, напишите нам по адресу [email protected] или позвоните нам по телефону +44 (0) 1527 584495 , чтобы поговорить с одним из наших экспертов. Узнайте больше о наших услугах по анализу аминокислот.
.

Цистеин | Атлас аминокислот

Источники

Цистеин — заменимая аминокислота

Что такое цистеин?

Формула цистеина

Чем полезен цистеин?

В каких продуктах много цистеина?

Добавки цистеина

L-цистеин — «Гиорд»

Цистеин — инструкция по применению

Содержание в организме

Биологические функции

Содержание в продуктах питания

Получение

Применение

Объявления о защитах диссертаций,Диссертационный совет

ЦИСТЕИН — это… Что такое ЦИСТЕИН?

Л-Цистеин | L-Cysteine

Цистеин — обзор | Темы ScienceDirect

2.1 Недолговечный железо-диоксидный комплекс в ферментах цистеиндиоксигеназы

Перекрестные помехи между цистином и глутатионом имеют решающее значение для регуляции сигнальных путей аминокислот и ферроптоза.

Материалы

Обработка клеток

Вестерн-блот

Количественная ПЦР в реальном времени

Измерение GSH

Измерение активных форм кислорода и перекисного окисления липидов

Анализы жизнеспособности клеток

Определение гибели клеток путем окрашивания PI

Статистический анализ

Связь между наличием цистеина в белках и сложностью организмов | Молекулярная биология и эволюция

Абстрактные

Введение

Материалы и методы

Последовательности белков, файлы данных последовательностей и анализ аминокислотного состава

Коррекция данных аминокислотного состава для содержания ГХ по сравнению с содержанием AT кодирующей ДНК

Анализ аминокислотного расстояния и гомологии белков

Результаты

Встречаемость цистеина в белках разных видов

Встречаемость цистеина в рибосомных белках различных видов

Содержание GC по сравнению с содержанием AU кодирующих ДНК и их связь с появлением цистеинов

Неслучайное присутствие остатков цистеина в белках разных видов

Обсуждение

цитированная литература

Реконструкция биосинтеза цистеина с использованием сконструированных безцистеиновых ферментов

Дизайн генов для безцистеиновых генов

Дизайн для генов без цистеина и с дефицитом метионина

Визуализация структур белков CysE и CysM

Синтез, клонирование и трансформация гена

Ауксотрофный

Подготовка электрокомпетентных клеток

Функциональный скрининг ферментативной функции биосинтеза цистеина

Анализ кривой роста

Клонирование и очистка рекомбинантных белков

Измерение активности CysE и CysM

Доступность данных

Границы | Истощение запасов цистеина, ключевое действие, направленное на предотвращение гибели ферроптотических клеток в раковых клетках

Введение

Цистеин, ключевой игрок в метаболизме опухолей

Глутатион: гомеостаз и функции

Цистеин, перекиси липидов и ферроптоз

Глутатион-зависимый ферроптоз

Глутатион-независимый ферроптоз

Заключение и оставшиеся вопросы

Авторские взносы

Конфликт интересов

Благодарности

Список литературы

новых доказательств: как аминокислота цистеин борется с болезнью Хантингтона

Поделитесь быстрыми фактами

Анализ триптофана, цистеина и цистина от AltaBioscience

Структура триптофана, цистеина и цистина

Вам так же может понравиться...

Гликоген относится к чему: Состав, свойства и функции углеводов — урок. Биология, 9 класс.

Подтягивания на бицепс: можно ли накачать огромные руки на турнике?

С чем качать ноги в один день: Какие мышцы лучше тренировать вместе

Добавить комментарий Отменить ответ