Атф структурная единица: Строение и функции АТФ. Видеоурок. Биология 10 Класс

Каково значение атф. Структура АТФ

В теле человека около 70 триллионов клеток. Для здорового роста каждой из них необходимы помощники — витамины. Молекулы витаминов малы, но их недостаток всегда заметен. Если тяжело адаптироваться к темноте, вам нужны витамины А и В2, появилась перхоть — не хватает B12, B6, P, долго не заживают синяки — дефицит витамина С. На этом уроке вы узнаете о том, как и где в клетке хранится и обрабатывается стратегический запас витаминов, как витамины активизируют работу организма, а также узнаете об АТФ — главном источнике энергии в клетке.

Тема: Основы цитологии

Урок: Строение и функции АТФ

Как вы помните, нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидов . Оказалось, что в клетке нуклеотиды могут находиться в связанном состоянии или в свободном состоянии. В свободном состоянии они выполняют ряд важных для жизнедеятельности организма функций.

К таким свободным нуклеотидам относится молекула АТФ

или аденозинтрифосфорная кислота (аденозинтрифосфат). Как и все нуклеотиды, АТФ состоит из пятиуглеродного сахара — рибозы , азотистого основания — аденина , и, в отличие от нуклеотидов ДНК и РНК, трех остатков фосфорной кислоты (рис. 1).

Рис. 1. Три схематических изображения АТФ

Важнейшая функция АТФ состоит в том, что она является универсальным хранителем и переносчиком энергии в клетке.

Все биохимические реакции в клетке, которые требуют затрат энергии, в качестве ее источника используют АТФ.

При отделении одного остатка фосфорной кислоты, АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфат ). Если отделяется ещё один остаток фосфорной кислоты (что случается в особых случаях), АДФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфат) (рис. 2).

Рис. 2. Гидролиза АТФ и превращение её в АДФ

При отделении второго и третьего остатков фосфорной кислоты освобождается большое количество энергии, до 40 кДж. Именно поэтому связь между этими остатками фосфорной кислоты называют макроэргической и обозначают соответственным символом.

При гидролизе обычной связи выделяется (или поглощается) небольшое количество энергии, а при гидролизе макроэргической связи выделяется намного больше энергии (40 кДж). Связь между рибозой и первым остатком фосфорной кислоты не является макроэргической, при её гидролизе выделяется всего 14 кДж энергии.

Макроэргические соединения могут образовываться и на основе других нуклеотидов, например ГТФ (гуанозинтрифосфат) используется как источник энергии в биосинтезе белка, принимает участие в реакциях передачи сигнала, является субстратом для синтеза РНК в процессе транскрипции, но именно АТФ является наиболее распространенным и универсальным источником энергии в клетке.

АТФ содержится как в цитоплазме , так и в ядре, митохондриях и хлоропластах .

Таким образом, мы вспомнили, что такое АТФ, каковы её функции, и что такое макроэргическая связь.

Витамины — биологически активные органические соединения, которые в малых количествах необходимы для подержания процессов жизнедеятельности в клетке.

Они не являются структурными компонентами живой материи, и не используются в качестве источника энергии.

Большинство витаминов не синтезируются в организме человека и животных, а поступают в него с пищей, некоторые синтезируются в небольших количествах микрофлорой кишечника и тканями (витамин D синтезируется кожей).

Потребность человека и животных в витаминах не одинакова и зависит от таких факторов как пол, возраст, физиологическое состояние и условия среды обитания. Некоторые витамины нужны не всем животным.

Например, аскорбиновая кислота, или витамин С, необходим человеку и другим приматам. Вместе с тем, он синтезируется в организме рептилий (моряки брали в плавания черепах, для борьбы с цингой — авитаминозом витамина С).

Витамины были открыты в конце XIX века благодаря работам русских ученых Н. И. Лунина и В. Пашутина, которые показали, что для полноценного питания необходимо не только наличие белков, жиров и углеводов, но и ещё каких-то других, на тот момент неизвестных, веществ.

В 1912 году польский ученый К. Функ (Рис. 3), изучая компоненты шелухи риса, предохраняющей от болезни Бери-Бери (авитаминоз витамина В), предположил, что в состав этих веществ обязательно должны входить аминные группировки. Именно он предложили назвать эти вещества витаминами, то есть аминами жизни.

В дальнейшем было установлено, что многие из этих веществ аминогрупп не содержат, но термин витамины хорошо прижился в языке науки и практики.

По мере открытия отдельных витаминов, их обозначали латинскими буквами и называли в зависимости от выполняемых функций. Например, витамин Е назвали токоферол (от др.-греч. τόκος — «деторождение», и φέρειν — «приносить»).

Сегодня витамины делят по их способности растворяться в воде или в жирах.

К водорастворимым витаминам относят витамины H , C , P , В .

К жирорастворимым витаминам относят A , D , E , K (можно запомнить, как слово: кеда ) .

Как уже было отмечено, потребность в витаминах зависит от возраста, пола, физиологического состояния организма и среды обитания. В молодом возрасте отмечена явная нужда в витаминах. Ослабленный организм тоже требует больших доз этих веществ. С возрастом способность усваивать витамины падает.

Потребность в витаминах также определяется способностью организма их утилизировать.

В 1912 году польский ученый Казимир Функ получил из шелухи риса частично очищенный витамин B1 — тиамин. Ещё 15 лет понадобилось для получения этого вещества в кристаллическом состоянии.

Кристаллический витамин B1 бесцветен, обладает горьковатым вкусом и хорошо растворим в воде. Тиамин найден как в растительных, так и микробных клетках. Особенно много его в зерновых культурах и дрожжах (рис. 4).

Рис. 4. Тиамин в виде таблеток и в продуктах питания

Термическая обработка пищевых продуктов и различные добавки разрушают тиамин. При авитаминозе наблюдаются патологии нервной, сердечно-сосудистой и пищеварительной систем. Авитаминоз приводит к нарушению водного обмена и функции кроветворения. Один из ярких примеров авитаминоза тиамина — это развитие болезни Бери-Бери (рис. 5).

Рис. 5. Человек, страдающий от авитаминоза тиамина — болезни бери-бери

Витамин В1 широко применяется в медицинской практике для лечения различных нервных заболеваний, сердечно-сосудистых расстройств.

В хлебопечении тиамин вместе с другим витаминами — рибофлавином и никотиновой кислотой используется для витаминизации хлебобулочных изделий.

В 1922 году Г. Эванс и

А. Бишо открыли жирорастворимый витамин, названный ими токоферолом или витамином Е (дословно: «способствующий родам»).

Витамин Е в чистом виде — маслянистая жидкость. Он широко распространен в злаковых культурах, например в пшенице. Его много в растительных, животных жирах (рис. 6).

Рис. 6. Токоферол и продукты, которые его содержат

Много витамина E в моркови, в яйцах и молоке. Витамин E является антиоксидантом , то есть защищает клетки от патологического окисления, которое приводит их к старению и гибели. Он является «витамином молодости». Огромно значение витамина для половой системы, поэтому его часто называют витамином размножения.

Вследствие этого, дефицит витамина Е, в первую очередь, приводит к нарушению эмбриогенеза и работы репродуктивных органов.

Производство витамина Е основано на выделении его из зародышей пшеницы — методом спиртовой экстракции и отгонки растворителей при низких температурах.

В медицинской практике используют как природные, так и синтетические препараты — токоферолаацетат в растительном масле, заключенный в капсулу (знаменитый «рыбий жир»).

Препараты витамина Е используются как антиоксиданты при облучениях и других патологических состояниях, связанных с повышенным содержанием в организме ионизированных частиц и активных форм кислорода.

Кроме того, витамин Е назначают беременным женщинам, а также используют в комплексной терапии лечения бесплодия, при мышечной дистрофии и некоторых заболеваниях печени.

Витамин А (рис. 7) был открыт Н. Друммондом в 1916 году.

Этому открытию предшествовали наблюдения за наличием жирорастворимого фактора в пище, необходимого для полноценного развития сельскохозяйственных животных.

Витамин А недаром занимает первое место в витамином алфавите. Он участвует практически во всех процессах жизнедеятельности. Этот витамин необходим для восстановления и сохранения хорошего зрения.

Он также помогает вырабатывать иммунитет ко многим заболеваниям, в том числе и простудным.

Без витамина А невозможно здоровое состояние эпителия кожи. Если у вас «гусиная кожа», которая чаще всего появляется на локтях, бедрах, коленях, голенях, если появилась сухость кожи на руках или возникают другие подобные явления, это означает, что вам недостает витамина А.

Витамин А, как и витамин Е, необходим для нормального функционирования половых желез (гонад). При гиповитаминозе витамина А отмечено повреждение репродуктивной системы и органов дыхания.

Одним из специфических последствий недостатка витамина А является нарушение процесса зрения, в частности снижение способности глаз к темновой адаптации — куриная слепота . Авитаминоз приводит к возникновению ксерофтальмии и разрушению роговицы. Последний процесс необратим, и характеризуется полной потерей зрения. Гипервитаминоз приводит к воспалению глаз и нарушению волосяного покрова, потери аппетита и полному истощению организма.

Рис. 7. Витамин А и продукты, которые его содержат

Витамины группы А, в первую очередь, содержатся в продуктах животного происхождения: в печени, в рыбьем жире, в масле, в яйцах (рис. 8).

Рис. 8. Содержание витамина А в продуктах растительного и животного происхождения

В продуктах растительного происхождения содержатся каротиноиды, которые в организме человека под действием фермента каротиназы переходят в витамин А.

Таким образом, Вы познакомились сегодня со структурой и функциями АТФ, а также вспомнили о значении витаминов и выяснили, как некоторые из них участвуют в процессах жизнедеятельности.

При недостаточном поступлении витаминов в организм развивается первичный авитаминоз. Разные продукты содержат разное количество витаминов.

Например, морковь содержит много провитамина А (каротина), капуста содержит витамин С и т. д. Отсюда проистекает необходимость сбалансированной диеты, включающей в себя разнообразные продукты растительного и животного происхождения.

Авитаминоз при нормальных условиях питания встречается очень редко, гораздо чаще встречаются гиповитаминозы , которые связаны с недостаточным поступлением с пищей витаминов.

Гиповитаминоз может возникать не только в результате несбалансированного питания, но и как следствие различных патологий со стороны желудочно-кишечного тракта или печени, или в результате различных эндокринных или инфекционных заболеваний, которые приводят к нарушению всасывания витаминов в организме.

Некоторые витамины вырабатываются кишечной микрофлорой (микробиотой кишечника). Подавление биосинтетических процессов в результате действия антибиотиков может также привести к развитию гиповитаминоза , как следствия дисбактериоза .

Чрезмерное употребление пищевых витаминных добавок, а также лекарственных средств, содержащих витамины, приводит к возникновению патологического состояния — гипервитаминоза . Особенно это характерно для жирорастворимых витаминов, таких как A , D , E , K .

Домашнее задание

1. Какие вещества называют биологически активными?

2. Что такое АТФ? В чем особенность строения молекулы АТФ? Какие типы химической связи существуют в этой комплексной молекуле?

3. Каковы функции АТФ в клетках живых организмов?

4. Где происходит синтез АТФ? Где осуществляется гидролиз АТФ?

5. Что такое витамины? Каковы их функции в организме?

6. Чем витамины отличаются от гормонов?

7. Какие классификации витаминов вам известны?

8. Что такое авитаминоз, гиповитаминоз и гипервитаминоз? Приведите примеры этих явлений.

9. Какие заболевания могут быть следствием недостаточного или избыточного поступления витаминов в организм?

10. Обсудите с друзьями и родственниками свое меню, подсчитайте, пользуясь дополнительной информацией о содержании витаминов в разных продуктах питания, достаточно ли витаминов вы получаете.

1. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

2. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

3. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

Список литературы

1. Каменский А. А., Криксунов Е. А., Пасечник В. В. Общая биология 10-11 класс Дрофа, 2005.

2. Беляев Д. К. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. — 11-е изд., стереотип. — М.: Просвещение, 2012. — 304 с.

3. Агафонова И. Б., Захарова Е. Т., Сивоглазов В. И. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. — 6-е изд., доп. — Дрофа, 2010. — 384 с.

В биологии АТФ — это источник энергии и основа жизни. АТФ — аденозинтрифосфат — участвует в процессах метаболизма и регулирует биохимические реакции в организме.

Что это?

Понять, что такое АТФ, поможет химия. Химическая формула молекулы АТФ — C10h26N5O13P3. Запомнить полное название несложно, если разбить его на составные части. Аденозинтрифосфат или аденозинтрифосфорная кислота — нуклеотид, состоящий из трёх частей:

• аденина — пуринового азотистого основания;
• рибозы — моносахарида, относящегося к пентозам;
• трёх остатков фосфорной кислоты.

Рис. 1. Строение молекулы АТФ.

Более подробная расшифровка АТФ представлена в таблице.

АТФ впервые обнаружили гарвардские биохимики Суббарао, Ломан, Фиске в 1929 году. В 1941 году немецкий биохимик Фриц Липман установил, что АТФ является источником энергии живого организма.

Образование энергии

Фосфатные группы соединены между собой высокоэнергетическими связями, которые легко разрушаются. При гидролизе (взаимодействии с водой) связи фосфатной группы распадаются, высвобождая большое количество энергии, а АТФ превращается в АДФ (аденозиндифосфорную кислоту).

Условно химическая реакция выглядит следующим образом:

ТОП-4 статьи которые читают вместе с этой

АТФ + Н2О → АДФ + Н3РО4 + энергия

Рис. 2. Гидролиз АТФ.

Часть высвободившейся энергии (около 40 кДж/моль) участвует в анаболизме (ассимиляции, пластическом обмене), часть — рассеивается в виде тепла для поддержания температуры тела. При дальнейшем гидролизе АДФ отщепляется ещё одна фосфатная группа с высвобождением энергии и образованием АМФ (аденозин-монофосфата). АМФ гидролизу не подвергается.

Синтез АТФ

АТФ располагается в цитоплазме, ядре, хлоропластах, в митохондриях. Синтез АТФ в животной клетке происходит в митохондриях, а в растительной — в митохондриях и хлоропластах.

АТФ образуется из АДФ и фосфата с затратой энергии. Такой процесс называется фосфорилированием:

АДФ + Н3РО4 + энергия → АТФ + Н2О

Рис. 3. Образование АТФ из АДФ.

В растительных клетках фосфорилирование происходит при фотосинтезе и называется фотофосфорилированием. У животных процесс протекает при дыхании и называется окислительным фосфорилированием.

В животных клетках синтез АТФ происходит в процессе катаболизма (диссимиляции, энергетического обмена) при расщеплении белков, жиров, углеводов.

Функции

Из определения АТФ понятно, что эта молекула способна давать энергию. Помимо энергетической аденозинтрифосфорная кислота выполняет другие функции:

• является материалом для синтеза нуклеиновых кислот;
• является частью ферментов и регулирует химические процессы, ускоряя или замедляя их протекание;
• является медиатором — передаёт сигнал синапсам (местам контакта двух клеточных мембран).

Что мы узнали?

Из урока биологии 10 класса узнали о строении и функциях АТФ — аденозинтрифосфорной кислоты. АТФ состоит из аденина, рибозы и трёх остатков фосфорной кислоты. При гидролизе фосфатные связи разрушаются, что высвобождает энергию, необходимую для жизнедеятельности организмов.

Тест по теме

Оценка доклада

Средняя оценка: 4.6 . Всего получено оценок: 621.

Продолжение. См. № 11, 12, 13, 14, 15, 16/2005

Расширенное планирование, 10 класс

Урок 19. Химическое строение и биологическая роль АТФ

Оборудование: таблицы по общей биологии, схема строения молекулы АТФ, схема взаимосвязи пластического и энергетического обменов.

I. Проверка знаний

Проведение биологического диктанта «Органические соединения живой материи»

Учитель читает тезисы под номерами, учащиеся записывают в тетрадь номера тех тезисов, которые подходят по содержанию их варианту.

Вариант 1 – белки.
Вариант 2 – углеводы.
Вариант 3 – липиды.
Вариант 4 – нуклеиновые кислоты.

1. В чистом виде состоят только из атомов С, Н, О.

2. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и обычно S.

3. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и Р.

4. Обладают относительно небольшой молекулярной массой.

5. Молекулярная масса может быть от тысяч до нескольких десятков и сотен тысяч дальтон.

6. Наиболее крупные органические соединения с молекулярной массой до нескольких десятков и сотен миллионов дальтон.

7. Обладают различными молекулярными массами – от очень небольшой до весьма высокой, в зависимости от того, является ли вещество мономером или полимером.

8. Состоят из моносахаридов.

9. Состоят из аминокислот.

10. Состоят из нуклеотидов.

11. Являются сложными эфирами высших жирных кислот.

12. Основная структурная единица: «азотистое основание–пентоза–остаток фосфорной кислоты».

13. Основная структурная единица: «аминокислот».

14. Основная структурная единица: «моносахарид».

15. Основная структурная единица: «глицерин–жирная кислота».

16. Молекулы полимеров построены из одинаковых мономеров.

17. Молекулы полимеров построены из сходных, но не вполне одинаковых мономеров.

18. Не являются полимерами.

19. Выполняют почти исключительно энергетическую, строительную и запасающую функции, в некоторых случаях – защитную.

20. Помимо энергетической и строительной выполняют каталитическую, сигнальную, транспортную, двигательную и защитную функции;

21. Осуществляют хранение и передачу наследственных свойств клетки и организма.

Вариант 1 – 2; 5; 9; 13; 17; 20.
Вариант 2 – 1; 7; 8; 14; 16; 19.
Вариант 3 – 1; 4; 11; 15; 18; 19.
Вариант 4 – 3; 6; 10; 12; 17; 21.

II. Изучение нового материала

1. Строение аденозинтрифосфорной кислоты

Кроме белков, нуклеиновых кислот, жиров и углеводов в живом веществе синтезируется большое количество других органических соединений. Среди них важнуую роль в биоэнергетике клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). АТФ содержится во всех клетках растений и животных. В клетках чаще всего аденозинтрифосфорная кислота присутствует в виде солей, называемых аденозинтрифосфатами . Количество АТФ колеблется и в среднем составляет 0,04% (в клетке в среднем находится около 1 млрд молекул АТФ). Наибольшее количество АТФ содержится в скелетных мышцах (0,2–0,5%).

Молекула АТФ состоит из азотистого основания – аденина, пентозы – рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, т.е. АТФ – особый адениловый нуклеотид. В отличие от других нуклеотидов АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты. АТФ относится к макроэргическим веществам – веществам, содержащим в своих связях большое количество энергии.

Пространственная модель (А) и структурная формула (Б) молекулы АТФ

Из состава АТФ под действием ферментов АТФаз отщепляется остаток фосфорной кислоты. АТФ имеет устойчивую тенденцию к отделению своей концевой фосфатной группы:

АТФ 4– + Н 2 О ––> АДФ 3– + 30,5 кДж + Фн,

т.к. это приводит к исчезновению энергетически невыгодного электростатического отталкивания между соседними отрицательными зарядами. Образовавшийся фосфат стабилизируется за счет образования энергетически выгодных водородных связей с водой. Распределение заряда в системе АДФ + Фн становится более устойчивым, чем в АТФ. В результате этой реакции высвобождается 30,5 кДж (при разрыве обычной ковалентной связи высвобождается 12 кДж).

Для того, чтобы подчеркнуть высокую энергетическую «стоимость» фосфорно-кислородной связи в АТФ, ее принято обозначать знаком ~ и называть макроэнергетической связью. При отщеплении одной молекулы фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорная кислота), а если отщепляются две молекулы фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфорная кислота). Отщепление третьего фосфата сопровождается выделением всего 13,8 кДж, так что собственно макроэргических связей в молекуле АТФ только две.

2. Образование АТФ в клетке

Запас АТФ в клетке невелик. Например, в мышце запасов АТФ хватает на 20–30 сокращений. Но ведь мышца способна работать часами и производить тысячи сокращений. Поэтому наряду с распадом АТФ до АДФ в клетке должен непрерывно идти обратный синтез. Существует несколько путей синтеза АТФ в клетках. Познакомимся с ними.

1. Анаэробное фосфорилирование. Фосфорилированием называют процесс синтеза АТФ из АДФ и низкомолекулярного фосфата (Фн). В данном случае речь идет о бескислородных процессах окисления органических веществ (например, гликолиз – процесс бескислородного окисления глюкозы до пировиноградной кислоты). Примерно 40% выделяемой в ходе этих процессов энергии (около 200 кДж/моль глюкозы), расходуется на синтез АТФ, а остальная часть рассеивается в виде тепла:

С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн ––> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

2. Окислительное фосфорилирование – это процесс синтеза АТФ за счет энергии окисления органических веществ кислородом. Этот процесс был открыт в начале 1930-х гг. XX в. В.А. Энгельгардтом. Кислородные процессы окисления органических веществ протекают в митохондриях. Примерно 55% выделяющейся при этом энергии (около 2600 кДж/моль глюкозы) превращается в энергию химических связей АТФ, а 45% рассеивается в виде тепла.

Окислительное фосфорилирование значительно эффективнее анаэробных синтезов: если в процессе гликолиза при распаде молекулы глюкозы синтезируется всего 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования образуется 36 молекул АТФ.

3. Фотофосфорилирование – процесс синтеза АТФ за счет энергии солнечного света. Этот путь синтеза АТФ характерен только для клеток, способных к фотосинтезу (зеленые растения, цианобактерии). Энергия квантов солнечного света используется фотосинтетиками в световую фазу фотосинтеза для синтеза АТФ.

3. Биологическое значение АТФ

АТФ находится в центре обменных процессов в клетке, являясь связующим звеном между реакциями биологического синтеза и распада. Роль АТФ в клетке можно сравнить с ролью аккумулятора, так как в ходе гидролиза АТФ выделяется энергия, необходимая для различных процессов жизнедеятельности («разрядка»), а в процессе фосфорилирования («зарядка») АТФ вновь аккумулирует в себе энергию.

За счет выделяющейся при гидролизе АТФ энергии происходят почти все процессы жизнедеятельности в клетке и организме: передача нервных импульсов, биосинтез веществ, мышечные сокращения, транспорт веществ и др.

III. Закрепление знаний

Решение биологических задач

Задача 1. При быстром беге мы часто дышим, происходит усиленное потоотделение. Объясните эти явления.

Задача 2. Почему на морозе замерзающие люди начинают притопывать и подпрыгивать?

Задача 3. В известном произведении И.Ильфа и Е.Петрова «Двенадцать стульев» среди многих полезных советов можно найти и такой: «Дышите глубже, вы взволнованы». Попробуйте обосновать этот совет с точки зрения происходящих в организме энергетических процессов.

IV. Домашнее задание

Начать подготовку к зачету и контрольной работе (продиктовать вопросы зачета – см. урок 21).

Урок 20. Обобщение знаний по разделу «Химическая организация жизни»

Оборудование: таблицы по общей биологии.

I. Обобщение знаний раздела

Работа учащихся с вопросами (индивидуально) с последующими проверкой и обсуждением

1. Приведите примеры органических соединений, в состав которых входят углерод, сера, фосфор, азот, железо, марганец.

2. Как по ионному составу можно отличить живую клетку от мертвой?

3. Какие вещества находятся в клетке в нерастворенном виде? В какие органы и ткани они входят?

4. Приведите примеры макроэлементов, входящих в активные центры ферментов.

5. Какие гормоны содержат микроэлементы?

6. Какова роль галогенов в организме человека?

7. Чем белки отличаются от искусственных полимеров?

8. Чем отличаются пептиды от белков?

9. Как называется белок, входящий в состав гемоглобина? Из скольких субъединиц он состоит?

10. Что такое рибонуклеаза? Сколько аминокислот входит в ее состав? Когда она была синтезирована искусственно?

11. Почему скорость химических реакций без ферментов мала?

12. Какие вещества транспортируются белками через клеточную мембрану?

13. Чем отличаются антитела от антигенов? Содержат ли вакцины антитела?

14. На какие вещества распадаются белки в организме? Сколько энергии выделяется при этом? Где и как обезвреживается аммиак?

15. Приведите пример пептидных гормонов: как они участвуют в регуляции клеточного метаболизма?

16. Какова структура сахара, с которым мы пьем чай? Какие еще три синонима этого вещества вы знаете?

17. Почему жир в молоке не собирается на поверхности, а находится в виде суспензии?

18. Какова масса ДНК в ядре соматической и половой клеток?

19. Какое количество АТФ используется человеком в сутки?

20. Из каких белков люди изготавливают одежду?

Первичная структура панкреатической рибонуклеазы (124 аминокислоты)

II. Домашнее задание.

Продолжить подготовку к зачету и контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 21. Зачетный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение устного зачета по вопросам

1. Элементарный состав клетки.

2. Характеристика органогенных элементов.

3. Структура молекулы воды. Водородная связь и ее значение в «химии» жизни.

4. Свойства и биологические функции воды.

5. Гидрофильные и гидрофобные вещества.

6. Катионы и их биологическое значение.

7. Анионы и их биологическое значение.

8. Полимеры. Биологические полимеры. Отличия периодических и непериодических полимеров.

9. Свойства липидов, их биологические функции.

10. Группы углеводов, выделяемые по особенностям строения.

11. Биологические функции углеводов.

12. Элементарный состав белков. Аминокислоты. Образование пептидов.

13. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

14. Биологические функция белков.

15. Отличия ферментов от небиологических катализаторов.

16. Строение ферментов. Коферменты.

17. Механизм действия ферментов.

18. Нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды и их строение. Образование полинуклеотидов.

19. Правила Э.Чаргаффа. Принцип комплементарности.

20. Образование двухцепочечной молекулы ДНК и ее спирализация.

21. Классы клеточной РНК и их функции.

22. Отличия ДНК и РНК.

23. Репликация ДНК. Транскрипция.

24. Строение и биологическая роль АТФ.

25. Образование АТФ в клетке.

II. Домашнее задание

Продолжить подготовку к контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 22. Контрольный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение письменной контрольной работы

Вариант 1

1. Имеются три вида аминокислот – А, В, С. Сколько вариантов полипептидных цепей, состоящих из пяти аминокислот, можно построить. Укажите эти варианты. Будут ли эти полипептиды обладать одинаковыми свойствами? Почему?

2. Все живое в основном состоит из соединений углерода, а аналог углерода – кремний, содержание которого в земной коре в 300 раз больше, чем углерода, встречается лишь в очень немногих организмах. Объясните этот факт с точки зрения строения и свойств атомов этих элементов.

3. В одну клетку ввели молекулы АТФ, меченные радиоактивным 32Р по последнему, третьему остатку фосфорной кислоты, а в другую – молекулы АТФ, меченные 32Р по первому, ближайшему к рибозе остатку. Через 5 минут в обеих клетках померили содержание неорганического фосфат-иона, меченного 32Р. Где оно окажется значительно выше?

4. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 18% – на урацил, 28% – на цитозин и 20% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Вариант 2

1. Жиры составляют «первый резерв» в энергетическом обмене и используются, когда исчерпан резерв углеводов. Однако в скелетных мышцах при наличии глюкозы и жирных кислот в большей степени используются последние. Белки же в качестве источника энергии всегда используются лишь в крайнем случае, при голодании организма. Объясните эти факты.

2. Ионы тяжелых металлов (ртути, свинца и др.) и мышьяка легко связываются сульфидными группировками белков. Зная свойства сульфидов этих металлов, объясните, что произойдет с белком при соединении с этими металлами. Почему тяжелые металлы являются ядами для организма?

3. В реакции окисления вещества А в вещество В освобождается 60 кДж энергии. Сколько молекул АТФ может быть максимально синтезировано в этой реакции? Как будет израсходована остальная энергия?

4. Исследования показали, что 27% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 15% – на урацил, 18% – на цитозин и 40% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Продолжение следует

АТФ и другие соединения клетки (витамины)

Особо важную роль в биоэнергетике клетки играет адениловый нуклеотид, к которому присоединены два остатка фосфорной кислоты. Такое вещество называют аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ).

В химических связях между остатками фосфорной кислоты молекулы АТФ запасена энергия, которая освобождается при отщеплении органического фосфата: АТФ = АДФ + Ф + Е, где Ф — фермент, Е — освобождающаяся энергия. В этой реакции образуется аденозиндифосфорная кислота (АДФ) — остаток молекулы АТФ и органический фосфат.

Энергию АТФ все клетки используют для процессов биосинтеза, движения, производства тепла, нервных импульсов, свечений (например, у люминесцентных бактерий), т.е. для всех процессов жизнедеятельности.

АТФ — универсальный биологический аккумулятор энергии, который синтезируется в митохондриях (внутриклеточных органоидах).

Митохондрия, таким образом, исполняет в клетке роль «энергетической станции». Принцип образования АТФ в хлоропластах клеток растений в общем тот же — использование протонного градиента и преобразование энергии электрохимического градиента в энергию химических связей.

Световая энергия Солнца и энергия, заключенная в потребляемой пище, запасается в молекулах АТФ. Запас АТФ в клетке невелик. Так, в мышце запаса АТФ хватает на 20-30 сокращений. При усиленной, но кратковременной работе мышцы работают исключительно за счет расщепления содержащейся в них АТФ. После окончания работы человек усиленно дышит — в этот период происходит расщепление углеводов и других веществ (происходит накопление энергии) и запас АТФ в клетках восстанавливается протонов. Протоны проходят через этот канал под действием движущей силы электрохимического градиента. Энергия этого процесса используется ферментом, содержащимся в тех же самых белковых комплексах и способным присоединить фосфатную группу к аденозиндифосфату (АДФ), что и приводит к синтезу АТФ.

Витамины: Vita — жизнь.

Витамины — биологически активные вещества, синтезирующиеся в организме или поступающие с пищей, которые в малых количествах необходимы для нормального обмена веществ и жизнедеятельности организма.

В 1911г. Польский химик К. Функ выделил из рисовых отрубей вещество, излечивающее параличи голубей, питавшихся только полированным рисом. Химический анализ этого вещества показал, что в его состав входит азот.

Открытое им вещество Функ назвал витамином (от слов «вита»- жизнь и «амин»- содержащий азот.

Биологическая роль витаминов заключается в их регулярном действии на обмен веществ. Витамины обладают каталитическими свойствами, то есть способностью стимулировать химические реакции, протекающие в организме, а также активно участвуют в образовании и функции ферментов. Витамины влияют на усвоение организмом питательных веществ, способствуют нормальному росту клеток и развитию всего организма. Являясь составной частью ферментов, витамины определяют их нормальную функцию и активность. Таким образом, недостаток в организме какого-либо витамина ведет к нарушению процессов обмена веществ.

Группы витаминов:

СУТОЧНАЯ ПОТРЕБНОСТЬ В ВИТАМИНАХ

С — аскорбиновая кислота: 70 — 100 мг.

В — тиамин: 1,5 — 2,6 мг.

В — рибофлавин: 1,8 — 3 мг.

А — ретинол: 1,5 мг.

D — кальциферол: для детей и взрослых 100 МЕ,

до 3 лет 400 МЕ.

Е — токоферол: 15 — 20 мг.

В любой клетке нашего организма протекают миллионы биохимических реакций. Они катализируются множеством ферментов, которые зачастую требуют затрат энергии. Где же клетка ее берет? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть строение молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.

АТФ — универсальный источник энергии

АТФ расшифровывается как аденозинтрифосфат, или аденозинтрифосфорная кислота. Вещество является одним из двух наиболее важных источников энергии в любой клетке. Строение АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций может протекать только при участии молекул вещества, особенно это касается Однако АТФ редко непосредственно участвует в реакции: для протекания любого процесса нужна энергия, заключенная именно в аденозинтрифосфата.

Строение молекул вещества таково, что образующиеся связи между фосфатными группами несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи также называются макроэргическими, или макроэнергетическими (макро=много, большое количество). Термин впервые ввел ученый Ф. Липман, и он же предложил использовать значок ̴ для их обозначения.

Очень важно для клетки поддерживать постоянный уровень содержания аденозинтрифосфата. Особенно это характерно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и для выполнения своих функций нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата.

Строение молекулы АТФ

Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков

Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз. Это значит, что в составе рибозы 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с аденином β-N-гликозидной связь на 1-ом атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-ом атоме углерода.

Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединяется к рибозе, выделяют также ГТФ (гуанозинтрифосфат), ТТФ (тимидинтрифосфат), ЦТФ (цитидинтрифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат). Все эти вещества схожи по строению с аденозинтрифосфатом и выполняют примерно такие же функции, однако они встречаются в клетке намного реже.

Остатки фосфорной кислоты . К рибозе может присоединиться максимально три остатка фосфорной кислоты. Если их два или только один, то соответственно вещество называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между фосфорными остатками заключены макроэнергетические связи, после разрыва которых высвобождается от 40 до 60 кДж энергии. Если разрываются две связи, выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. При разрыве связи между рибозой и фосфорным остатком выделяется всего лишь 13,8 кДж, поэтому в молекуле трифосфата только две макроэргические связи (Р ̴ Р ̴ Р), а в молекуле АДФ — одна (Р ̴ Р).

Вот каковы особенности строения АТФ. По причине того, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, строение и функции АТФ связаны между собой.

Строение АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата

Кроме энергетической, АТФ может выполнять множество других функций в клетке. Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами трифосфат участвует в построении нуклеиновый кислот. В этом случае АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и УТФ являются поставщиками азотистых оснований. Это свойство используется в процессах и транскрипции.

Также АТФ необходим для работы ионных каналов. Например, Na-K канал выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и вкачивает 2 молекулы калия в клетку. Такой ток ионов нужен для поддержания положительного заряда на наружной поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать. То же касается протонных и кальциевых каналов.

АТФ является предшественником вторичного мессенжера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами мембраны клетки, но и является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Так, циклический аденозинтрифосфат ингибирует синтез фермента, который катализирует расщепление лактозы в клетках бактерии.

Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором. Причем в подобных процессах антагонистом АТФ выступает АДФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат затормаживает, и наоборот. Таковы функции и строение АТФ.

Как образуется АТФ в клетке

Функции и строение АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Поэтому синтез трифосфата — это важный процесс образования энергии в клетке.

Выделяют три наиболее важных способа синтеза аденозинтрифосфата:

1. Субстратное фосфорилирование.

2. Окислительное фосфорилирование.

3. Фотофосфорилирование.

Субстратное фосфорилирование основано на множественных реакциях, протекающих в цитоплазме клетки. Эти реакции получили название гликолиза — анаэробный этап В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется две молекулы которые дальше используются для получения энергии, и также синтезируются два АТФ.

• С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн —> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

Дыхание клетки

Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем передачи электронов по электронно-транспортной цепи мембраны. В результате такой передачи формируется градиент протонов на одной из сторон мембраны и с помощью белкового интегрального комплекта АТФ-синтазы идет построение молекул. Процесс протекает на мембране митохондрий.

Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс под названием дыхание. После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.

Фотофосфорилирование

Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование лишь с одним отличием: реакции фотофосфорилирования протекают в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется во время световой стадии фотосинтеза — основного процесса получения энергии у зеленых растений, водорослей и некоторых бактерий.

В процессе фотосинтеза все по той же электронно-транспортной цепи проходят электроны, в результате чего формируется протонный градиент. Концентрация протонов на одной из сторон мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется посредством фермента АТФ-синтазы.

В среднестатистической клетке содержится 0,04% аденозинтрифосфата от всей массы. Однако самое большое значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.

В клетке около 1 млрд молекул АТФ.

Каждая молекула живет не больше 1 минуты.

Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется в день 2000-3000 раз.

В сумме за сутки организм человека синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.

Заключение

Строение АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в процессах жизнедеятельности, ведь в макроэргических связях между фосфатными остатками содержится огромное количество энергии. Аденозинтрифосфат выполняет множество функций в клетке, и поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию вещества. Распад и синтез идут с большой скоростью, т. к. энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество любой клетки организма. Вот, пожалуй, и все, что можно сказать о том, какое строение имеет АТФ.

Материалы для организации дистанционного обучения. «Биология» (10–11 классы)

Класс	Название урока	Ссылка на учебные материалы
10	Биология как комплексная наука	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3827/main/118944/
10	Биологические системы как предмет изучения биологии	https://infourok.ru/videouroki/12
10	Молекулярные основы жизни. Неорганические вещества, их значение	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5397/start/270098/
10	Органические вещества (углеводы, липиды) и их значение. Биополимеры	https://infourok.ru/videouroki/31 https://infourok.ru/videouroki/32
10	Органические вещества. Белки. Значение белков	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3840/main/163100/
10	Органические вещества клетки – нуклеиновые кислоты и их значение. АТФ	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3840/main/163100/
10	Цитология, методы цитологии. Клетка – структурная и функциональная единица организма. Роль клеточной теории в становлении современной естественно-научной картины мира	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5383/start/153371/
10	Клетки прокариот и эукариот. Основные части и органоиды клетки, их строение и функции. Строение и функции хромосом	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5383/start/153371/ https://resh.edu.ru/subject/lesson/3847/start/8616/
10	Сравнение строения клеток растений, животных, грибов и бактерий	https://infourok.ru/videouroki/5
10	Вирусы – неклеточная форма жизни, меры профилактики вирусных заболеваний	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3939/main/105169/
10	Жизнедеятельность клетки. Пластический обмен. Фотосинтез, хемосинтез	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3917/main/46781/
10	Энергетический обмен	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3917/main/46781/
10	Хранение, передача и реализация наследственной информации в клетке. Ген. Геном	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5352/main/8295/ https://resh.edu.ru/subject/lesson/3939/main/105169/
10	Биосинтез белка	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5352/main/8295/
10	Клеточный цикл: интерфаза и деление. Митоз, значение	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3927/main/105899/
10	Мейоз. Значение мейоза	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3927/main/105899/
10	Организм – единое целое. Жизнедеятельность организма	https://www.youtube.com/watch?v=xNbLtpyNeGE
10	Размножение организмов	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5359/main/271003/
10	Организм. Индивидуальное развитие организмов	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5630/main/132924/ https://resh.edu.ru/subject/lesson/5385/main/119868/
10	Генетика. Методы генетики. Генетическая терминология и символика	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5386/main/74574/
10	Законы наследственности	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5386/main/74574/ https://resh.edu.ru/subject/lesson/4725/main/107951/
10	Хромосомная теория наследственности	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4755/main/118832/
10	Определение пола. Сцепленное с полом наследование	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4755/main/118832/
10	Генетика человека. Методы изучения генетики человека. Наследственные заболевания человека и их профилактика	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3653/main/47183/ https://infourok.ru/videouroki/28
10	Генотип и среда. Ненаследственная изменчивость	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5387/main/17439/ https://resh.edu.ru/subject/lesson/5387/main/17439/
10	Наследственная изменчивость. Мутации	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5387/main/17439/
10	Основы селекции. Методы селекции. Биотехнология, её направления и перспективы развития	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3861/main/106016/
11	Развитие эволюционных идей	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5393/main/132001/
11	Эволюционная теория Ч. Дарвина. Синтетическая теория эволюции	https://infourok.ru/videouroki/35
11	Свидетельства эволюции живой природы	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5391/main/119918/
11	Вид. Критерии вида	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4949/main/119947/
11	Микроэволюция. Видообразование. Популяция – элементарная единица эволюции	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4949/main/119947/
11	Факторы (движущие силы) эволюции	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5388/main/17613/
11	Естественный отбор и его результаты	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5388/main/17613/
11	Направления эволюции	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4950/main/47358/
11	Многообразие организмов как результат эволюции. Приспособленность	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5390/main/17698/
11	Принципы классификации. Систематика	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5395/start/107347/
11	Гипотезы происхождения жизни на Земле	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4950/main/47358/
11	Основные этапы эволюции органического мира на Земле	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3885/main/270131/
11	Основные этапы развития жизни на Земле (архей, протерозой)	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/istoriya-razvitiya-zhizni-v-arheyskuyu-i-proterozoyskuyu-eru
11	Основные этапы развития жизни на Земле (ранний палеозой)	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/istoriya-razvitiya-zhizni-v-paleozoyskuyu-eru-ch-1
11	Основные этапы развития жизни на Земле (поздний палеозой)	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/istoriya-razvitiya-zhizni-v-paleozoyskuyu-eru-ch-2
11	Основные этапы развития жизни на Земле (мезозой и кайнозой)	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/istoriya-razvitiya-zhizni-v-mezozoyskuyu-eru-ch-1 https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/istoriya-razvitiya-zhizni-v-mezozoyskuyu-eru-ch-2 https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/bistoriya-razvitiya-zhizni-na-zemleb/razvitie-zhizni-v-kaynozoyskuyu-eru
11	Современные представления о происхождении человека. Эволюция человека (антропогенез). Движущие силы антропогенеза	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4951/main/107500/
11	Движущие силы антропогенеза. Расы человека, их происхождение и единство. Человек – биосоциальное существо	https://resh.edu.ru/subject/lesson/3906/main/161179/
11	Приспособление организмов к действию экологических факторов	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5392/main/
11	Биогеоценоз. Экосистема	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5501/main/119079/
11	Свойства и разнообразие экосистем	https://resh.edu.ru/subject/lesson/4953/main/105426/
11	Разнообразие экосистем	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/osnovy-ekologii/vzaimodeystvie-organizma-i-sredy-ekosistemy-biogeotsenozy
11	Взаимоотношения популяций разных видов в экосистеме	https://infourok.ru/videouroki/49
11	Круговорот веществ в экосистеме	https://infourok.ru/videouroki/53
11	Устойчивость и динамика экосистем	https://infourok.ru/videouroki/54
11	Последствия влияния деятельности человека на экосистемы. Сохранение биоразнообразия как основа устойчивости экосистемы	https://interneturok.ru/lesson/biology/11-klass/vzaimodeystvie-cheloveka-i-prirody/vozdeystvie-cheloveka-na-prirodu-v-protsesse-stanovleniya-obschestva
11	Структура биосферы. Закономерности существования биосферы	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5394/main/119108/ https://infourok.ru/videouroki/61
11	Роль человека в биосфере. Глобальные антропогенные изменения в биосфере. Проблемы устойчивого развития	https://resh.edu.ru/subject/lesson/5499/main/132030/

Строение АТФ и биологическая роль. Функции АТФ. АТФ и его роль в клетке. Функции митохондрий клетки

На рисунке представлены два способа изображения структуры АТФ . Аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ) относятся к классу соединений, называемых нуклеогидами. Молекула нук-леотида состоит из пятиуглеродного сахара, азотистого основания и фосфорной кислоты. В молекуле АМФ сахар представлен рибо-зой, а основание — аденином. В молекуле АДФ две фосфатные группы, а в молекуле АТФ — три.

Значение АТФ

При расщеплении АТФ на АДФ и неорганический фосфат (Фн) высвобождается энергия:

Реакция идет с поглощением воды , т. е. представляет собой гидролиз (в нашей статье мы много раз встречались с этим весьма распространенным типом биохимических реакций). Отщепившаяся от АТФ третья фосфатная группа остается в клетке в виде неорганического фосфата (Фн). Выход свободной энергии при этой реакции составляет 30,6 кДж на 1 моль АТФ.

Из АДФ и фосфата может быть вновь синтезирован АТФ, но для этого требуется затратить 30,6 кДж энергии на 1 моль вновь образованного АТФ.

В этой реакции , называемой реакцией конденсации, вода выделяется. Присоединение фосфата к АДФ называется реакцией фосфорилирования. Оба приведенных выше уравнения можно объединить:

Катализирует данную обратимую реакцию фермент, называемый АТФазой .

Всем клеткам, как уже было сказано, для выполнения их работы необходима энергия и для всех клеток любого организма источником этой энергии служит АТФ . Поэтому АТФ называют «универсальным носителем энергии» или «энергетической валютой» клеток. Подходящей аналогией служат электрические батарейки. Вспомните, для чего только мы их не используем. Мы можем получать с их помощью в одном случае свет, в другом звук, иногда механическое движение, а иногда нам нужна от них собственно электрическая энергия. Удобство батареек в том, что один и тот же источник энергии — батарейку — мы можем использовать для самых разных целей в зависимости от того, куда мы ее поместим. Эту же роль играет в клетках АТФ. Он поставляет энергию для таких различных процессов, как мышечное сокращение, передача нервных импульсов, активный транспорт веществ или синтез белков, и для всех прочих видов клеточной активности. Для этого он должен быть просто «подключен» к соответствующей части аппарата клетки.

Аналогию можно продолжить. Батарейки требуется сначала изготовить, а некоторые из них (аккумуляторные) так же, как и , можно перезарядить. При изготовлении батареек на фабрике в них должно быть заложено (и тем самым израсходовано фабрикой) определенное количество энергии. Для синтеза АТФ тоже требуется энергия; источником ее служит окисление органических веществ в процессе дыхания. Поскольку для фосфорилирования АДФ энергия высвобождается в процессе окисления, такое фосфорилирование называют окислительным. При фотосинтезе АТФ образуется за счет световой энергии. Этот процесс называют фотофос-форилированием (см. разд. 7.6.2). Есть в клетке и «фабрики», производящие большую часть АТФ. Это митохондрии; в них размешаются химические «сборочные линии», на которых образуется АТФ в процессе аэробного дыхания. Наконец, в клетке происходит и перезарядка разрядившихся «аккумуляторов»: после того как АТФ, высвободив заключенную в нем энергию, превратится в АДФ и Фн, он может быть вновь быстро синтезирован из АДФ и Фн за счет энергии, полученной в процессе дыхания от окисления новой порции органических веществ.

Количество АТФ в клетке в любой данный момент очень невелико. Поэтому в АТФ следует видеть только носителя энергии, а не ее депо. Для длительного хранения энергии служат такие вещества, как жиры или гликоген. Клетки весьма чувствительны к уровню АТФ. Как только скорость его использования возрастает, одновременно возрастает и скорость процесса дыхания, поддерживающего этот уровень.

Роль АТФ в качестве связующего звена между клеточным дыханием и процессами, идущими с потреблением энергии, видна из рисунка Схема эта выглядит простой, но она иллюстрирует очень важную закономерность.

Можно, таким образом, сказать, что в целом функция дыхания заключается в том, чтобы вырабатывать АТФ .

Суммируем вкратце сказанное выше.
1. Для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата требуется 30,6 кДж энергии на 1 моль АТФ.
2. АТФ присутствует во всех живых клетках и является, следовательно, универсальным носителем энергии. Другие носители энергии не используются. Это упрощает дело — необходимый клеточный аппарат может быть более простым и работать более эффективно и экономно.
3. АТФ легко доставляет энергию в любую часть клетки к любому нуждающемуся в энергии процессу.
4. АТФ быстро высвобождает энергию. Для этого требуется всего лишь одна реакция — гидролиз.
5. Скорость воспроизводства АТФ из АДФ и неорганического фосфата (скорость процесса дыхания) легко регулируется в соответствии с потребностями.
6. АТФ синтезируется во время дыхания за счет химической энергии, высвобождаемой при окислении таких органических веществ, как глюкоза, и во время фотосинтеза — за счет солнечной энергии. Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата называют реакцией фос-форилирования. Если энергию для фос-форилирования поставляет окисление, то говорят об окислительном фосфорилиро-вании (этот процесс протекает при дыхании), если же для фосфорилирования используется световая энергия, то процесс называют фотофосфорилированием (это имеет место при фотосинтезе).

Основным источником энергии для клетки являются питательные вещества: углеводы, жиры и белки, которые окисляются с помощью кислорода. Практически все углеводы, прежде чем достичь клеток организма, благодаря работе желудочно-кишечного тракта и печени превращаются в глюкозу. Наряду с углеводами расщепляются также белки — до аминокислот и липиды — до жирных кислот.В клетке питательные вещества окисляются под действием кислорода и при участии ферментов, контролирующих реакции высвобождения энергии и ее утилизацию.

Почти все окислительные реакции происходят в митохондриях, а высвобождаемая энергия запасается в виде макроэргического соединения — АТФ. В дальнейшем для обеспечения внутриклеточных метаболических процессов энергией используется именно АТФ, а не питательные вещества.

Молекула АТФ содержит: (1) азотистое основание аденин; (2) пентозный углевод рибозу, (3) три остатка фосфорной кислоты. Два последних фосфата соединены друг с другом и с остальной частью молекулы макроэргическими фосфатными связями, обозначенными на формуле АТФ символом ~. При соблюдении характерных для организма физических и химических условий энергия каждой такой связи составляет 12000 калорий на 1 моль АТФ, что во много раз превышает энергию обычной химической связи, поэтому фосфатные связи и называют макроэргическими. Более того, эти связи легко разрушаются, обеспечивая внутриклеточные процессы энергией сразу, как только в этом возникает необходимость.

При высвобождении энергии АТФ отдает фосфатную группу и превращается в аденозиндифосфат. Выделившаяся энергия используется практически для всех клеточных процессов, например в реакциях биосинтеза и при мышечном сокращении.

Схема образования аденозинтрифосфата в клетке, показывающая ключевую роль митохондрий в этом процессе.
GI — глюкоза; FA — жирные кислоты; АА — аминокислота.

Восполнение запасов АТФ происходит путем воссоединения АДФ с остатком фосфорной кислоты за счет энергии питательных веществ. Этот процесс повторяется вновь и вновь. АТФ постоянно расходуется и накапливается, поэтому она получила название энергетической валюты клетки. Время оборота АТФ составляет всего несколько минут.

Роль митохондрий в химических реакциях образования АТФ . При попадании внутрь клетки глюкоза под действием ферментов цитоплазмы превращается в пировиноградную кислоту (этот процесс называют гликолизом). Энергия, высвобождаемая в этом процессе, затрачивается на превращение небольшого количества АДФ в АТФ, составляющего менее 5% общих запасов энергии.

На 95% осуществляется в митохондриях. Пировиноградная кислота, жирные кислоты и аминокислоты, образующиеся соответственно из углеводов, жиров и белков, в матриксе митохондрий в итоге превращаются в соединение под названием «ацетил-КоА». Это соединение, в свою очередь, вступает в серию ферментативных реакций под общим названием «цикл трикарбоновых кислот» или «цикл Кребса», чтобы отдать свою энергию.

В цикле трикарбоновых кислот ацетил-КоА расщепляется до атомов водорода и молекул углекислого газа. Углекислый газ удаляется из митохондрий, затем — из клетки путем диффузии и выводится из организма через легкие.

Атомы водорода химически очень активны и поэтому сразу вступают в реакцию с кислородом, диффундирующим в митохондрии. Большое количество энергии, выделяющейся в этой реакции, используется для превращения множества молекул АДФ в АТФ. Эти реакции достаточно сложны и требуют участия огромного числа ферментов, входящих в состав крист митохондрий. На начальном этапе от атома водорода отщепляется электрон, и атом превращается в ион водорода. Процесс заканчивается присоединением ионов водорода к кислороду. В результате этой реакции образуются вода и большое количество энергии, необходимой для работы АТФ-синтетазы — крупного глобулярного белка, выступающего в виде бугорков на поверхности крист митохондрий. Под действием этого фермента, использующего энергию ионов водорода, АДФ превращается в АТФ. Новые молекулы АТФ направляются из митохондрий ко всем отделам клетки, включая ядро, где энергия этого соединения используется для обеспечения самых разных функций.
Данный процесс синтеза АТФ в целом называют хемиосмотическим механизмом образования АТФ.

Использование аденозинтрифосфата митохондрий для реализации трех важных функций клетки:
мембранного транспорта, синтеза белка и мышечного сокращения.

Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Всё это реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного переноса молекул через биологические мембраны, в том числе и для создания трансмембранного электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения .

Как известно в биоэнергетике живых организмов имеют значение два основных момента:

• а) химическая энергия запасается путём образования АТФ, сопряжённого с экзергоническими катаболическими реакциями окисления органических субстратов;
• б) химическая энергия утилизируется путём расщепления АТФ, сопряжённого с эндергоническими реакциями анаболизма и другими процессами, требующими затраты энергии .

Встаёт вопрос, почему молекула АТФ соответствует своей центральной роли в биоэнергетике. Для его разрешения рассмотрим структуру АТФ Структура АТФ — (при рН 7,0 тетразаряд аниона) .

АТФ представляет собой термодинамически нестойкое соединение. Нестабильность АТФ определяется, во — первых, электростатическим отталкиванием в области кластера одноимённых отрицательных зарядов, что приводит к напряжению всей молекулы, однако сильнее всего связи — Р — О — Р, и во — вторых, конкретным резонансом. В соответствии с последним фактором существует конкуренция между атомами фосфора за неподелённые подвижные электроны атома кислорода, расположенного между ними, поскольку на каждом атоме фосфора имеется частичный положительный заряд в следствии значительного электронаицепторного влияния групп Р=О и Р — О-. Таким образом, возможность существования АТФ определяется наличием достаточного количества химической энергии в молекуле, позволяющей компенсировать эти физико — химические напряжения. В молекуле АТФ имеется две фосфоангидридных (пирофосфатных) связи, гидролиз которых сопровождается значительным уменьшением свободной энергии (при рН 7,0 и 37 о С).

АТФ+Н 2 О = АДФ + Н 3 РО 4 G0I = — 31,0 КДж/моль.

АДФ+Н 2 О = АМФ +Н 3 РО 4 G0I = — 31,9 КДж/моль.

Одной из центральных проблем биоэнергетики является биосинтез АТФ, который в живой природе происходит путём Фосфорилирование АДФ.

Фосфорилирование АДФ является эндергоническим процессом и требует источника энергии. Как отмечалось ранее, в природе преобладает два таких источника энергии — это солнечная энергия и химическая энергия восстановленных органических соединений. Зелёные растения и некоторые микроорганизмы способны трансформировать энергию, поглощённых квантов света в химическую энергию, которая расходуется на фосфорилирование АДФ в световой стадии фотосинтеза. Этот процесс регенерации АТФ получил название фотосинтетического фосфорилирования. Трансформация энергии окисления органических соединений в макроэнергетические связи АТФ в аэробных условиях происходит преимущественно путём окислительного фосфорилирования. Свободная энергия, необходимая для образования АТФ, генерируется в дыхательной окислительной цепи митаходрий.

Известен ещё один тип синтеза АТФ, получивший название субстратного фосфорилирования. В отличии от окислительного фосфорилирования, сопряжённого с переносом электронов, донором активированной фосфорильной группой (- РО3 Н2), необходимой для регенерации АТФ, являются интермедианты процессов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот. Во всех этих случаях окислительные процессы приводят к образованию высокоэнергетических соединений: 1,3 — дифосфоглицерата (гликолиз), сукцинил — КоА (цикл трикарбоновых кислот), которые при участии соответствующих ферментов способны фолирировать АДФ и образовывать АТФ. Трансформация энергии на уровне субстрата является единственным путём синтеза АТФ в анаэробных организмах. Этот процесс синтеза АТФ позволяет поддерживать интенсивную работу скелетных мышц в периоды кислородного голодания. Следует помнить, что он является единственным путём синтеза АТФ в зрелых эритроцитах не имеющих митохондрий.

Особо важную роль в биоэнергетике клетки играет адениловый нуклеотид, и которому присоединены два остатка фосфорной кислоты. Такой вещество называется аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ). В химических связях между остатками фосфорной кислоты молекулы АТФ запасена энергия, которая освобождается при отщеплении органического фосфорита:

АТФ= АДФ+Ф+Е,

где Ф — фермент, Е — освобождающая энергия. В этой реакции образуется аденозинфосфорная кислота (АДФ) — остаток молекулы АТФ и органический фосфат. Энергию АТФ все клетки используют для процессов биосинтеза, движения, производство тепла, нервных импульсов, свечений (например, улюминисцентных бактерий), то есть для всех процессов жизнедеятельности .

АТФ — универсальный биологический аккумулятор энергии. Световая энергия, заключенная в потребляемой пище, запасается в молекулы АТФ.

Запас АТФ в клетке невелик. Так, в мышце запаса АТФ хватает на 20 — 30 сокращений. При усиленной, но кратковременной работе мышцы работают исключительно за счёт расщепления содержащейся в них АТФ. После окончания работы человек усиленно дышит — в этот период происходит расщепление углеводов и других веществ (происходит накопление энергии) и запас АТФ в клетках восстанавливается.

Помимо энергетической АТФ выполняет в организме ещё ряд других не менее важных функций:

• · Вместе с другими нуклеозидтрифосфатами АТФ является исходным продуктом при синтезе нуклеиновых кислот.
• · Кроме того, АТФ отводится важное место в регуляции множества биохимических процессов. Являясь аллостерическим эффектором ряда ферментов, АТФ, присоединяясь к их регуляторным центрам, усиливает или подавляет их активность.
• · АТФ является также непосредственным предшественником синтеза циклического аденозинмонофосфата — вторичного посредника передачи в клетку гормонального сигнала.

Также известна роль АТФ в качестве медиатора в синапсах .

Продолжение. См. № 11, 12, 13, 14, 15, 16/2005

Расширенное планирование, 10 класс

Урок 19. Химическое строение и биологическая роль АТФ

Оборудование: таблицы по общей биологии, схема строения молекулы АТФ, схема взаимосвязи пластического и энергетического обменов.

I. Проверка знаний

Проведение биологического диктанта «Органические соединения живой материи»

Учитель читает тезисы под номерами, учащиеся записывают в тетрадь номера тех тезисов, которые подходят по содержанию их варианту.

Вариант 1 – белки.
Вариант 2 – углеводы.
Вариант 3 – липиды.
Вариант 4 – нуклеиновые кислоты.

1. В чистом виде состоят только из атомов С, Н, О.

2. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и обычно S.

3. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и Р.

4. Обладают относительно небольшой молекулярной массой.

5. Молекулярная масса может быть от тысяч до нескольких десятков и сотен тысяч дальтон.

6. Наиболее крупные органические соединения с молекулярной массой до нескольких десятков и сотен миллионов дальтон.

7. Обладают различными молекулярными массами – от очень небольшой до весьма высокой, в зависимости от того, является ли вещество мономером или полимером.

8. Состоят из моносахаридов.

9. Состоят из аминокислот.

10. Состоят из нуклеотидов.

11. Являются сложными эфирами высших жирных кислот.

12. Основная структурная единица: «азотистое основание–пентоза–остаток фосфорной кислоты».

13. Основная структурная единица: «аминокислот».

14. Основная структурная единица: «моносахарид».

15. Основная структурная единица: «глицерин–жирная кислота».

16. Молекулы полимеров построены из одинаковых мономеров.

17. Молекулы полимеров построены из сходных, но не вполне одинаковых мономеров.

18. Не являются полимерами.

19. Выполняют почти исключительно энергетическую, строительную и запасающую функции, в некоторых случаях – защитную.

20. Помимо энергетической и строительной выполняют каталитическую, сигнальную, транспортную, двигательную и защитную функции;

21. Осуществляют хранение и передачу наследственных свойств клетки и организма.

Вариант 1 – 2; 5; 9; 13; 17; 20.
Вариант 2 – 1; 7; 8; 14; 16; 19.
Вариант 3 – 1; 4; 11; 15; 18; 19.
Вариант 4 – 3; 6; 10; 12; 17; 21.

II. Изучение нового материала

1. Строение аденозинтрифосфорной кислоты

Кроме белков, нуклеиновых кислот, жиров и углеводов в живом веществе синтезируется большое количество других органических соединений. Среди них важнуую роль в биоэнергетике клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). АТФ содержится во всех клетках растений и животных. В клетках чаще всего аденозинтрифосфорная кислота присутствует в виде солей, называемых аденозинтрифосфатами . Количество АТФ колеблется и в среднем составляет 0,04% (в клетке в среднем находится около 1 млрд молекул АТФ). Наибольшее количество АТФ содержится в скелетных мышцах (0,2–0,5%).

Молекула АТФ состоит из азотистого основания – аденина, пентозы – рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, т.е. АТФ – особый адениловый нуклеотид. В отличие от других нуклеотидов АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты. АТФ относится к макроэргическим веществам – веществам, содержащим в своих связях большое количество энергии.

Пространственная модель (А) и структурная формула (Б) молекулы АТФ

Из состава АТФ под действием ферментов АТФаз отщепляется остаток фосфорной кислоты. АТФ имеет устойчивую тенденцию к отделению своей концевой фосфатной группы:

АТФ 4– + Н 2 О ––> АДФ 3– + 30,5 кДж + Фн,

т.к. это приводит к исчезновению энергетически невыгодного электростатического отталкивания между соседними отрицательными зарядами. Образовавшийся фосфат стабилизируется за счет образования энергетически выгодных водородных связей с водой. Распределение заряда в системе АДФ + Фн становится более устойчивым, чем в АТФ. В результате этой реакции высвобождается 30,5 кДж (при разрыве обычной ковалентной связи высвобождается 12 кДж).

Для того, чтобы подчеркнуть высокую энергетическую «стоимость» фосфорно-кислородной связи в АТФ, ее принято обозначать знаком ~ и называть макроэнергетической связью. При отщеплении одной молекулы фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорная кислота), а если отщепляются две молекулы фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфорная кислота). Отщепление третьего фосфата сопровождается выделением всего 13,8 кДж, так что собственно макроэргических связей в молекуле АТФ только две.

2. Образование АТФ в клетке

Запас АТФ в клетке невелик. Например, в мышце запасов АТФ хватает на 20–30 сокращений. Но ведь мышца способна работать часами и производить тысячи сокращений. Поэтому наряду с распадом АТФ до АДФ в клетке должен непрерывно идти обратный синтез. Существует несколько путей синтеза АТФ в клетках. Познакомимся с ними.

1. Анаэробное фосфорилирование. Фосфорилированием называют процесс синтеза АТФ из АДФ и низкомолекулярного фосфата (Фн). В данном случае речь идет о бескислородных процессах окисления органических веществ (например, гликолиз – процесс бескислородного окисления глюкозы до пировиноградной кислоты). Примерно 40% выделяемой в ходе этих процессов энергии (около 200 кДж/моль глюкозы), расходуется на синтез АТФ, а остальная часть рассеивается в виде тепла:

С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн ––> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

2. Окислительное фосфорилирование – это процесс синтеза АТФ за счет энергии окисления органических веществ кислородом. Этот процесс был открыт в начале 1930-х гг. XX в. В.А. Энгельгардтом. Кислородные процессы окисления органических веществ протекают в митохондриях. Примерно 55% выделяющейся при этом энергии (около 2600 кДж/моль глюкозы) превращается в энергию химических связей АТФ, а 45% рассеивается в виде тепла.

Окислительное фосфорилирование значительно эффективнее анаэробных синтезов: если в процессе гликолиза при распаде молекулы глюкозы синтезируется всего 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования образуется 36 молекул АТФ.

3. Фотофосфорилирование – процесс синтеза АТФ за счет энергии солнечного света. Этот путь синтеза АТФ характерен только для клеток, способных к фотосинтезу (зеленые растения, цианобактерии). Энергия квантов солнечного света используется фотосинтетиками в световую фазу фотосинтеза для синтеза АТФ.

3. Биологическое значение АТФ

АТФ находится в центре обменных процессов в клетке, являясь связующим звеном между реакциями биологического синтеза и распада. Роль АТФ в клетке можно сравнить с ролью аккумулятора, так как в ходе гидролиза АТФ выделяется энергия, необходимая для различных процессов жизнедеятельности («разрядка»), а в процессе фосфорилирования («зарядка») АТФ вновь аккумулирует в себе энергию.

За счет выделяющейся при гидролизе АТФ энергии происходят почти все процессы жизнедеятельности в клетке и организме: передача нервных импульсов, биосинтез веществ, мышечные сокращения, транспорт веществ и др.

III. Закрепление знаний

Решение биологических задач

Задача 1. При быстром беге мы часто дышим, происходит усиленное потоотделение. Объясните эти явления.

Задача 2. Почему на морозе замерзающие люди начинают притопывать и подпрыгивать?

Задача 3. В известном произведении И.Ильфа и Е.Петрова «Двенадцать стульев» среди многих полезных советов можно найти и такой: «Дышите глубже, вы взволнованы». Попробуйте обосновать этот совет с точки зрения происходящих в организме энергетических процессов.

IV. Домашнее задание

Начать подготовку к зачету и контрольной работе (продиктовать вопросы зачета – см. урок 21).

Урок 20. Обобщение знаний по разделу «Химическая организация жизни»

Оборудование: таблицы по общей биологии.

I. Обобщение знаний раздела

Работа учащихся с вопросами (индивидуально) с последующими проверкой и обсуждением

1. Приведите примеры органических соединений, в состав которых входят углерод, сера, фосфор, азот, железо, марганец.

2. Как по ионному составу можно отличить живую клетку от мертвой?

3. Какие вещества находятся в клетке в нерастворенном виде? В какие органы и ткани они входят?

4. Приведите примеры макроэлементов, входящих в активные центры ферментов.

5. Какие гормоны содержат микроэлементы?

6. Какова роль галогенов в организме человека?

7. Чем белки отличаются от искусственных полимеров?

8. Чем отличаются пептиды от белков?

9. Как называется белок, входящий в состав гемоглобина? Из скольких субъединиц он состоит?

10. Что такое рибонуклеаза? Сколько аминокислот входит в ее состав? Когда она была синтезирована искусственно?

11. Почему скорость химических реакций без ферментов мала?

12. Какие вещества транспортируются белками через клеточную мембрану?

13. Чем отличаются антитела от антигенов? Содержат ли вакцины антитела?

14. На какие вещества распадаются белки в организме? Сколько энергии выделяется при этом? Где и как обезвреживается аммиак?

15. Приведите пример пептидных гормонов: как они участвуют в регуляции клеточного метаболизма?

16. Какова структура сахара, с которым мы пьем чай? Какие еще три синонима этого вещества вы знаете?

17. Почему жир в молоке не собирается на поверхности, а находится в виде суспензии?

18. Какова масса ДНК в ядре соматической и половой клеток?

19. Какое количество АТФ используется человеком в сутки?

20. Из каких белков люди изготавливают одежду?

Первичная структура панкреатической рибонуклеазы (124 аминокислоты)

II. Домашнее задание.

Продолжить подготовку к зачету и контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 21. Зачетный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение устного зачета по вопросам

1. Элементарный состав клетки.

2. Характеристика органогенных элементов.

3. Структура молекулы воды. Водородная связь и ее значение в «химии» жизни.

4. Свойства и биологические функции воды.

5. Гидрофильные и гидрофобные вещества.

6. Катионы и их биологическое значение.

7. Анионы и их биологическое значение.

8. Полимеры. Биологические полимеры. Отличия периодических и непериодических полимеров.

9. Свойства липидов, их биологические функции.

10. Группы углеводов, выделяемые по особенностям строения.

11. Биологические функции углеводов.

12. Элементарный состав белков. Аминокислоты. Образование пептидов.

13. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

14. Биологические функция белков.

15. Отличия ферментов от небиологических катализаторов.

16. Строение ферментов. Коферменты.

17. Механизм действия ферментов.

18. Нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды и их строение. Образование полинуклеотидов.

19. Правила Э.Чаргаффа. Принцип комплементарности.

20. Образование двухцепочечной молекулы ДНК и ее спирализация.

21. Классы клеточной РНК и их функции.

22. Отличия ДНК и РНК.

23. Репликация ДНК. Транскрипция.

24. Строение и биологическая роль АТФ.

25. Образование АТФ в клетке.

II. Домашнее задание

Продолжить подготовку к контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 22. Контрольный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение письменной контрольной работы

Вариант 1

1. Имеются три вида аминокислот – А, В, С. Сколько вариантов полипептидных цепей, состоящих из пяти аминокислот, можно построить. Укажите эти варианты. Будут ли эти полипептиды обладать одинаковыми свойствами? Почему?

2. Все живое в основном состоит из соединений углерода, а аналог углерода – кремний, содержание которого в земной коре в 300 раз больше, чем углерода, встречается лишь в очень немногих организмах. Объясните этот факт с точки зрения строения и свойств атомов этих элементов.

3. В одну клетку ввели молекулы АТФ, меченные радиоактивным 32Р по последнему, третьему остатку фосфорной кислоты, а в другую – молекулы АТФ, меченные 32Р по первому, ближайшему к рибозе остатку. Через 5 минут в обеих клетках померили содержание неорганического фосфат-иона, меченного 32Р. Где оно окажется значительно выше?

4. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 18% – на урацил, 28% – на цитозин и 20% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Вариант 2

1. Жиры составляют «первый резерв» в энергетическом обмене и используются, когда исчерпан резерв углеводов. Однако в скелетных мышцах при наличии глюкозы и жирных кислот в большей степени используются последние. Белки же в качестве источника энергии всегда используются лишь в крайнем случае, при голодании организма. Объясните эти факты.

2. Ионы тяжелых металлов (ртути, свинца и др.) и мышьяка легко связываются сульфидными группировками белков. Зная свойства сульфидов этих металлов, объясните, что произойдет с белком при соединении с этими металлами. Почему тяжелые металлы являются ядами для организма?

3. В реакции окисления вещества А в вещество В освобождается 60 кДж энергии. Сколько молекул АТФ может быть максимально синтезировано в этой реакции? Как будет израсходована остальная энергия?

4. Исследования показали, что 27% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 15% – на урацил, 18% – на цитозин и 40% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Продолжение следует

Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Всё это реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного переноса молекул черезбиологические мембраны, в том числе и для создания трансмембранного электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения.

Помимо энергетической АТФ выполняет в организме ещё ряд других не менее важных функций:

§ Вместе с другими нуклеозидтрифосфатами АТФ является исходным продуктом при синтезе нуклеиновых кислот.

§ Кроме того, АТФ отводится важное место в регуляции множества биохимических процессов. Являясь аллостерическим эффектором ряда ферментов, АТФ, присоединяясь к их регуляторным центрам, усиливает или подавляет их активность.

§ АТФ является также непосредственным предшественником синтеза циклического аденозинмонофосфата — вторичного посредника передачи в клетку гормонального сигнала.

Рибосома — важнейший немембранный органоид живой клетки сферической или слегка эллипсоидной формы, диаметром 100-200 ангстрем, состоящий из большой и малой субъединиц. Рибосомы служат для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК, или мРНК. Этот процесс называется трансляцией.

Химический состав клетки. Строение, свойства, значение ДНК.

См. 1.

Дезоксирибонуклеи́новая кислота́ (ДНК) — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК ибелков.

С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) ифосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название «двойной спирали».

Поделись статьей:

Похожие статьи

3. Строение клетки. Клеточные органоиды

Ядрышко представляет собой плотное округлое тело внутри ядра. Обычно в ядре клетки бывает от одного до семи ядрышек. Они хорошо видны между делениями клетки, а во время деления — разрушаются.
 

Функция ядрышек — синтез РНК и белков, из которых формируются особые органоиды — рибосомы.

Рибосомы участвуют в биосинтезе белка. В цитоплазме рибосомы чаще всего расположены на шероховатой эндоплазматической сети. Реже они свободно взвешены в цитоплазме клетки.

 

Эндоплазматическая сеть (ЭПС) участвует в синтезе белков клетки и транспортировке веществ внутри клетки.

 

 

Значительная часть синтезируемых клеткой веществ (белков, жиров, углеводов) не расходуется сразу, а по каналам ЭПС поступает для хранения в особые полости, уложенные своеобразными стопками, «цистернами», и отграниченные от цитоплазмы мембраной. Эти полости получили название аппарат (комплекс) Гольджи. Чаще всего цистерны аппарата Гольджи расположены вблизи от ядра клетки.

Аппарат Гольджи принимает участие в преобразовании белков клетки и синтезирует лизосомы — пищеварительные органеллы клетки.

Лизосомы представляют собой пищеварительные ферменты, «упаковываются» в мембранные пузырьки, отпочковываются и разносятся по цитоплазме.

В комплексе Гольджи также накапливаются вещества, которые клетка синтезирует для нужд всего организма и которые выводятся из клетки наружу.

 

Митохондрии — энергетические органоиды клеток. Они преобразуют питательные вещества в энергию (АТФ), участвуют в дыхании клетки.

 

Митохондрии покрыты двумя мембранами: наружная мембрана гладкая, а внутренняя имеет многочисленные складки и выступы — кристы.

 

 

В мембрану крист встроены ферменты, синтезирующие за счёт энергии питательных веществ, поглощённых клеткой, молекулы аденозинтрифосфата (АТФ).
АТФ — это универсальный источник энергии для всех процессов, происходящих в клетке.

Количество митохондрий в клетках различных живых существ и тканей неодинаково.
Например, в сперматозоидах может быть всего одна митохондрия. Зато в клетках тканей, где велики энергетические затраты (в клетках летательных мышц у птиц, в клетках печени), этих органоидов бывает до нескольких тысяч.

Митохондрии имеют собственную ДНК и могут самостоятельно размножаться (перед делением клетки число митохондрий в ней возрастает так, чтобы их хватило на две клетки).

Митохондрии содержатся во всех эукариотических клетках, а вот в прокариотических клетках их нет. Этот факт, а также наличие в митохондриях ДНК позволило учёным выдвинуть гипотезу о том, что предки митохондрий когда-то были свободноживущими существами, напоминающими бактерии. Со временем они поселились в клетках других организмов, возможно, паразитируя в них. А затем за многие миллионы лет превратились в важнейшие органоиды, без которых ни одна эукариотическая клетка не может существовать.

Плазматическая мембрана

отрядов специального реагирования | Бюро алкоголя, табака, огнестрельного оружия и взрывчатых веществ

Группы специального реагирования (СРТ) ATF — это элитные тактические группы, которые быстро реагируют на операции правоохранительных органов с высоким риском и проводят уголовные расследования, которые приводят к арестам самых жестоких преступников в Соединенных Штатах. Их работа включает в себя ордера на обыск и арест, уголовные расследования с высокой степенью риска, секретные операции, операции по наблюдению и операции по охране.

Члены команды — это специально обученные специальные агенты ATF, которые могут работать полный или неполный рабочий день. Они часто выполняют различные роли, такие как переговорщики по кризисным ситуациям, руководители групп, тактические операторы, снайперы, операторы-медики и кинологи.

В дополнение к своим оперативным обязанностям, члены SRT разрабатывают и внедряют тактические политики и процедуры правоохранительных органов для поддержки операций ATF. Они также обучают агентов АТФ обучению оперативным и защитным мерам противодействия.

Пять SRT

ATF стратегически базируются по всей стране в Детройте, Вашингтон, округ Колумбия.С., Даллас, Лос-Анджелес и Джексонвилл.

Тактика и обучение

Специальные агенты ATF, заинтересованные в присоединении к SRT, должны иметь как минимум трехлетний опыт работы и очень высокие баллы при оценке своей работы.

После отбора кандидаты посещают 15-дневную школу базовой подготовки SRT. Во время этой интенсивной программы они изучают специальные навыки, такие как меткая стрельба, манипулирование многочисленными системами оружия, индивидуальные и групповые тактические движения, тактическая медицина, развертывание химических агентов, использование менее смертоносных систем оружия, операции с бронетехникой, наблюдение, операции с вертолетами и оперативные операции. планирование.SRT также участвуют в строгих действиях, таких как защитная тактика, прорыв, спуск по веревке, быстрый спуск, патрулирование в сельской местности и операции.

Новые члены SRT проходят испытательный срок в течение одного года после завершения специализированного обучения, и все участники должны посещать ежеквартальные курсы повышения квалификации.Они также участвуют в других операционных тренингах в течение года, чтобы поддерживать свои навыки.

Активации

Группы специального реагирования

, как и их коллеги из национальных и международных групп реагирования, готовы выехать в любой момент, чтобы поддержать громкие дела. Они проводят в среднем 200 миссий в год, чтобы привлечь к ответственности виновных в насильственных преступлениях. Некоторые из их громких дел включают бомбардировку Бостонского марафона и Вашингтонский округ Колумбия.Военно-морская верфь, стрельба.

ATF, ЧТОБЫ ПОМОЧЬ ОБОЗНАЧИТЬ ПОЖАРЫ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

В течение многих лет способность пожарной службы округа Колумбия правильно выявлять поджоги и ловить поджигателей была ужасающей. Офицеры пожарной охраны либо жаловались, что не хватает персонала для выполнения этой работы, либо жаловались на отсутствие у полиции полномочий, которые, по их словам, им необходимы для проведения арестов.

На этой неделе начали поступать резервные копии.

Целевая группа из восьми агентов Управления по алкоголю, табаку и огнестрельному оружию Министерства финансов присоединилась к городскому отделу расследования пожаров, привезя с собой специалистов по поджогам и современное оборудование.

Чарльз Томсон, агент, отвечающий за вашингтонское полевое подразделение ATF, сказал, что такая договоренность позволит пожарной службе вступить в «новую эру» пожаротушения, выполнив правоохранительный аспект своей миссии.

С федеральными агентами, прикрывающими их, у следователей департамента по поджогам наконец будет время пойти в школу, чтобы получить необходимую им подготовку для работы.

Очень нужна помощь.

В 1997 финансовом году, который закончился 9 сентября.30, департамент классифицировал 207 пожаров как поджоги — из 3 421 общего пожара в строении. Эта цифра 207 является низкой по сравнению с другими городами сопоставимого размера, особенно с учетом того, что многие из 3421 структурных пожаров произошли в пустующих зданиях, что фактически привело к поджогам.

Цифры арестованных были ненамного лучше. По данным пожарной охраны, в связи с этими 207 поджогами произведено 29 задержаний.

«Поджог был большой проблемой в округе Колумбия в течение долгого времени, — сказал Лоуренс Мирел, юрист, представляющий интересы Д.C. Страховая федерация, отраслевая группа. «Это было… бесплатное преступление, поскольку никто никогда не привлекался к ответственности».

Мирель заявила, что жертвами поджогов в городе являются жители, а не только предприятия. «Произошла эпидемия поджогов жилых домов», — сказал он. Чаще всего это происходит, когда заброшенные здания захватывают наркоманы и торговцы наркотиками. Когда они поджигаются — иногда во время споров из-за наркотиков между конкурирующими торговцами — близлежащие дома оказываются под угрозой, а иногда и повреждаются, — сказала Мирел.

Поскольку у следователей по пожарным делам округа Колумбия исторически не было полномочий полиции производить аресты, в отличие от большинства крупных городов, им приходилось полагаться на городскую полицию, которая работала с ними по всем своим поджогам, а не только по тем, которые повлекли за собой смерть или серьезные травмы.

На протяжении многих лет эти два департамента боролись друг с другом, соревнуясь за внимание, которое приходит с раскрытием громкого дела о поджоге. Однако в последние годы полиция округа Колумбия столкнулась с другими, более серьезными преступлениями и административными проблемами, и она не могла помочь пожарной службе в возбуждении дел о поджогах, которые рассматривались бы в суде.Сегодня из-за выхода на пенсию и других сокращений подразделение по поджогам милиции практически не существует.

В конце 1996 года пожарные обнаружили проблемы и обратились в прокуратуру США за помощью в прохождении дополнительной подготовки. Исполняющая обязанности прокурора США Мэри Лу Лири заявила, что была сформирована рабочая группа, в которую вошли пожарные и полицейские управления и ATF.

Год обучения был запланирован для дюжины следователей по пожарным делам округа Колумбия. Пятеро из них начали первый шестимесячный этап обучения на этой неделе в городской полицейской академии, где они получат инструкции по основным полицейским процедурам.Когда эти пятеро закончат, оставшиеся семь следователей будут отправлены в академию.

Лири сказал, что за курсом академии последуют еще шесть месяцев специализированного обучения по сбору доказательств, расследованию поджогов и юридическим вопросам. Эта часть обучения будет проходить в различных школах правоохранительных органов по всей стране.

Пока следователи округа Колумбия идут в школу, агенты ATF будут их прикрывать. По словам Томсона из ATF, в случае необходимости будут назначены дополнительные агенты ATF.

Лири сказал, что два помощника прокурора США также будут назначены связными по поджогам, чтобы помогать объединять дела и проводить дополнительное обучение даче показаний в суде, написанию отчетов и решению других юридических вопросов.

Единственная нерешенная проблема — это решение Совета округа Колумбия по законопроекту, который на законных основаниях наделял бы следователей по пожарным расследованиям полицейскими полномочиями после того, как они закончат полицейскую академию. Лири сказала, что она ожидает, что закон будет вскоре одобрен.

Она сказала, что сотрудники правоохранительных органов рады проекту.«Мы осознали, что мы не получали дела о поджогах, и что мы должны были получить их. И мы осознали, что пожарная служба была ужасно неадекватна для этого», — сказала она.

Элвин Т. Картер, представитель пожарной охраны, сказал, что агентство не хочет останавливаться на прошлом. «Какими бы точными ни были преграды, сейчас они не мешают, — сказал он, — и это должно произойти».

Город — не единственный бенефициар сделки. ATF тоже кое-что получает взамен.Его агенты, некоторые из которых работают в сельской местности, получат возможность заниматься делами о поджогах в крупных городах.

«Приятно видеть такое сотрудничество между агентствами», — сказал Лири. «Вместо того, чтобы участвовать в битвах за территорию, они собираются вместе, чтобы убедиться, что это произойдет».

JunB определяет функциональную и структурную целостность эпидермально-волосяной единицы в коже

Экспрессия JunB в коже млекопитающих в различных условиях

Члены семейства AP-1 участвуют в гомеостазе кожи, особенно в регуляции терминально дифференцированных эпидермальных клеток ²¹ .Однако вклад отдельных членов семейства AP-1, в частности JunB, в нормальную физиологию и восстановление гомеостаза после вредных воздействий полностью не исследован.

Чтобы оценить экспрессию JunB во время созревания, мы выполнили иммуноокрашивание JunB в биоптатах кожи мыши и человека (рис. 1a-f). JunB сильно экспрессируется в верхнем слое кожи, в основном несущем терминально дифференцированные эпидермальные клетки (Fig. 1a-f). Этот вывод согласуется с более ранними отчетами ^22,23 .Неожиданно мы обнаружили интенсивное окрашивание JunB в сальных железах в разные моменты времени во время постнатального созревания кожи мышей (рис. 1a, b).

Рис. 1

Экспрессия JunB во время созревания кожи и при стрессе. a Репрезентативные микрофотографии с двойным иммуноокрашиванием для JunB (зеленый) и FABP5 (красный), указывающие на сальные железы, на коже мышей в возрасте 1, 3 и 5 дней. Врезка с увеличенным изображением сальной железы. Масштабные линейки 50 мкм. b Иммуноокрашивание JunB (зеленый) и FABP5 (красный) у 60-дневных мышей.Вставка с увеличенным изображением. c Типичные микрофотографии с двойным иммуноокрашиванием JunB (зеленый) и FABP5 (красный) на коже спины 60-дневных мышей после выщипывания волос или d после местного нанесения TPA, мощного индуктора пролиферации. e Иммуноокрашивание JunB (зеленый) и LRIG1 или CD34 (красный) в коже спины 60-дневных мышей после выщипывания волос. f Иммуноокрашивание JunB (зеленый) и FABP5 (красный) в коже взрослого человека. E, эпидермис; D — дерма; HF, волосяной фолликул; SG, сальная железа; SD, сальный проток; HS, стержень волоса.Звездочка указывает на автофлуоресценцию стержня волоса. Пунктирной линией обозначено соединение эпидермиса и дермы. Масштабные линейки, 50 мкм

В гомеостазе кожи мышей была обнаружена низкая скорость оборота эпидермальных клеток ²⁴ . Мы собираемся проанализировать экспрессию JunB в условиях повреждения и гиперпролиферации кожи, при которых кожа подвергается быстрой пролиферации и дифференцировке клеток. Следует отметить, что количество положительных клеток JunB существенно увеличивалось, когда кожа была нарушена либо микротравмами в результате выщипывания волос, либо в ответ на местный TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol 13-ацетат), который запускает пролиферацию через активацию передачи сигналов PKC ²⁵ ( Инжир.1в, г). Эти мощные стимулы значительно увеличивали экспрессию JunB не только в сальных железах, транзитных амплифицирующих клетках (TAC) и коммитированных предшественниках супрабазального слоя, но также в недифференцированных базальных эпидермальных клетках-предшественниках и более определенных стволовых клетках волосяных фолликулов (HFSC), включая LRIG1 или CD34-положительные популяции (рис. 1c – e, дополнительные рисунки 1A и 1B). Эти результаты были дополнительно подтверждены на уровне мРНК с использованием анализа количественной ПЦР. Фактически, мы обнаружили повышенную экспрессию специфической мРНК JunB как в FACS-отсортированных стволовых клетках CD34 ^{+ ve} и LRIG1 ^{+ ve} в ответ на депиляцию волос (дополнительные рисунки 1C и 1D).Экспрессия JunB также была обнаружена в сальных железах и других эпидермальных клетках кожи взрослого человека при физиологических условиях (рис. 1f). Наши результаты убедительно подтверждают более широкую роль JunB в гомеостазе кожи и, о чем ранее не сообщалось, экспрессия JunB не ограничивается исключительно терминально дифференцирующимся эпидермисом.

Для дальнейшего анализа роли JunB в базальном эпидермальном слое предшественников и находящихся в нем эпидермальных стволовых клетках, мы создали базальных эпидермальных клеток-предшественников, специфичных для гомозиготных мышей с дефицитом JunB, с использованием рекомбиназы Cre, управляемой промотором K14 (далее условный нокаут JunB, обозначаемый как JunB cKO) (дополнительные рисунки 2A, 2B и 2C).Удивительно, но мыши JunB cKO были меньше по размеру и имели меньшую массу тела по сравнению с мышами дикого типа (дополнительные рисунки 2D и 2E). Что еще более важно, взрослые (9–12 недель) мыши JunB cKO страдали от таких симптомов, как зуд и воспаление кожи лица и шеи (дополнительные рисунки 2D и 2F). В отличие от мышей дикого типа, шерсть взрослых мышей JunB cKO была влажной, скорее всего, из-за избыточной секреции желез или потери воды с кожи (дополнительный рисунок 2F). Выраженность этих симптомов с возрастом постепенно увеличивалась.Интересно, что эта мышиная модель с недостаточностью JunB в K14, экспрессирующая базальные эпидермальные предшественники, близко отражает себорейный дерматит человека клинически и гистологически. Как и при себорейном дерматите человека, наша модель выявила нерегулярную алопецию (выпадение волос), проявляющуюся эритематозом и слегка влажной кожей, покрытой шелушащимися чешуйками (дополнительные рисунки 2D и 2F). Подобно себорейному дерматиту человека, cKO JunB проявляли типичные гистологические особенности, включая гиперплазию сальных желез, гиперплазию эпидермиса с признаками спонгиоз (отек между эпидермальными клетками), паракератоз и сохранение инфильтрирующих воспалительных клеток (дополнительные рисунки 2G, 3A, 3B и 3C).Кожа JunB cKO обнаруживает повышенное количество макрофагов в дерме и межфолликулярном эпидермисе, что, скорее всего, отражает дефекты эпидермального барьера (дополнительный рисунок 3A). Кроме того, мы оценили трансэпидермальную потерю воды (TEWL), показывающую функцию эпидермального барьера в коже JunB cKO, с помощью измерителя TEWA. TEWL обратно пропорциональна функции кожного барьера. Интересно, что мы обнаружили повышенную потерю воды в эпидермисе, указывающую на плохую барьерную функцию в коже JunB cKO, в отличие от кожи дикого типа (дополнительный рисунок 3D).Взятые вместе, эти результаты указывают на критическую роль JunB в гомеостазе кожи и — в случае делеции JunB — приводят к развитию воспалительного заболевания кожи, сходного с себорейным дерматитом.

Нарушенный гомеостаз кожи у мышей JunB cKO

Расширенные сальные железы, наблюдаемые в коже шеи мышей JunB cKO, побудили нас более подробно проанализировать их характер экспрессии и функцию. Для этой цели биопсии кожи и хвоста неповрежденной кожи мышей JunB cKO и мышей дикого типа подвергали окрашиванию H&E или иммуноокрашиванию на белок, связывающий жирные кислоты 5 (FABP5), ключевой белок в сальных железах (рис.2a, b, дополнительные рисунки 4A и 4B). Интересно, что сальные железы мышей JunB cKO были значительно увеличены, что продемонстрировано окрашиванием H & E и FABP5 по сравнению с мышами дикого типа (фиг. 2a, b, дополнительные рисунки 4A и 4B). Затем мы проанализировали активность и количество HFSC. Интересно, что HFSC (CD34 ^{+ ve} alpha6-интегрин ^Hi ), выделенные из кожи мышей JunB cKO, образовывали значительно меньше колоний по сравнению с HFSC дикого типа (рис. 2c и дополнительный рисунок 4C), что свидетельствует о серьезном нарушении дифференцировки и самообновления. в JunB cKO HFSCs.Хотя мы не обнаружили какой-либо существенной разницы в количестве HFSC между JunB cKO и мышами дикого типа, количество дважды положительных CD34 ^{+ ve} альфа-6-интегрин ^Hi было немного выше в коже JunB cKO (рис. 2d). Следует отметить, что соотношение CD34 ^{+ ve} альфа6-интегрина ^Hi к CD34 ^{+ ve} альфа6-интегрина ^Low HFSC было увеличено у JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа (фиг. 2d и дополнительная фигура 4D). ), что указывает на дефект в поддержании гомеостаза стволовых клеток в отдельных субпопуляциях стволовых клеток bulge ²⁶ .Вместе эти результаты подчеркивают важную роль JunB в дифференцировке и поддержании HFSCs при нормальном гомеостазе ткани.

Рис. 2

ККО JunB демонстрируют нарушение гомеостаза кожи. a Репрезентативные микрофотографии с иммуноокрашиванием FABP5 (красный), свидетельствующим о сальных железах, на коже спины от мышей дикого типа и мышей JunB cKO. Ядра окрашены DAPI в синий цвет. Масштабные линейки 50 мкм. b Гистология кожи хвоста мышей дикого типа и мышей JunB cKO.Масштабные линейки 50 мкм. c Репрезентативная фотография анализа колониеобразующих единиц из очищенных FACS HFSC (CD34 ^{+ ve} α6Itg ^Hi ) из кожи спины мышей дикого типа и JunB cKO, которые культивировались in vitro в течение 2 недель, а затем окрашивались родамином B и Нильский синий. n = 3 мыши на генотип. d FACS-анализы из второй фазы телогена, демонстрирующие повышенное соотношение стволовых клеток волосяных фолликулов P2 и P1 (CD34 ^{+ ve} α6Itg ^Hi / CD34 ^{+ ve} α6Itg ^Low ) в ненарушенной коже дорсальной части с 60-дневного возраста JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа. e Конфокальные изображения всего эпидермиса хвоста показывают дифференцированные кератиноциты, иммуноокрашенные по маркеру терминальной дифференцировки k10 (зеленый) в JunB cKO по сравнению с кожей дикого типа. Ядра окрашены DAPI в синий цвет. Масштабные линейки 50 мкм. E, эпидермис; SG, сальная железа

В случае терминально дифференцирующихся эпидермальных клеток значительно сниженная экспрессия кератина 10 или K10, инволюкрина и лорикрина (маркеры для терминально дифференцированных кератиноцитов) была обнаружена в коже хвоста и спины мышей JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа. (Рис.2e, дополнительные рисунки 5A, 5B и 5C). Эти данные согласуются с более ранним сообщением, предполагающим участие JunB в терминальной дифференцировке ²¹ .

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о решающей роли JunB в регуляции сальных желез и эпидермального компартмента. Кроме того, наши данные убедительно указывают на активную роль JunB в гомеостазе кожи и, в случае нарушения регуляции, могут привести к повреждению стволовых клеток волосяного фолликула.

Нарушение заживления и гиперплазия сальных желез у JunB cKOs

Чтобы оценить, влияет ли дефицит JunB на регенеративную способность кожи, мы индуцировали макро- и микротравмы у мышей дикого типа и мышей JunB cKO.Интересно, что замедленное заживление полнослойных ран наблюдалось у мышей JunB cKO на 5, 7 и 10 день после ранения по сравнению с мышами дикого типа (фиг. 3a, b). Гиперпластический утолщенный эпидермис с паракератотическим роговым слоем и усиленным воспалением наблюдался у JunB cKO по сравнению с кожей JunB cKO дикого типа и неповрежденной кожей JunB cKO (фиг. 3b и дополнительный рисунок 4A). Кроме того, мы обнаружили впечатляюще увеличенные сальные железы в местах ран у JunB cKO (рис. 3b). Эти результаты указывают на важную, пока не известную роль JunB в регуляции кератиноцитов и их предшественников во время восстановления и регенерации кожи.

Рис. 3

Нарушение заживления ран и стрессовая реакция у мышей JunB cKO. Мыши a JunB cKO демонстрируют замедленное заживление ран по сравнению с мышами дикого типа после иссечения круговой биопсии на всю толщину толщиной 6 мм. ** P <0,001, однофакторный дисперсионный анализ ( n = 7) b Репрезентативные микрофотографии H&E 10-дневной раны, изображающие гиперпластический и утолщенный эпидермис и увеличенные сальные железы у мышей JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа.Масштабные линейки 50 мкм. c Усиленная гиперплазия эпидермальных и сальных желез у JunB cKO на 5 день после выщипывания волос. Изображение на вставке показывает противоположную роль JunB (красный) в пролиферирующих клетках, отмеченных зеленым цветом Ki67. Количественная оценка размера сальных желез после выщипывания волос, *** P <0,001, t -тест ( n = 3). d Местное применение TPA, сильного усилителя пролиферации, в течение 7 дней заметно вызывало гиперплазию эпидермиса и сальных желез.Количественная оценка размера сальных желез после применения TPA, *** P <0,001, t-тест ( n = 3). E, эпидермис; D — дерма; HF, волосяной фолликул; SG, сальная железа; SC, подкожный слой; PC, panniculus carnosus. Масштабные линейки, 50 мкм

Точно так же микротравмы из-за выщипывания волос значительно индуцировали гиперплазию эпидермиса и сальных желез у JunB cKO (рис. 3c). Сальные железы сКО JunB приняли шарообразную морфологию, в то время как они остаются относительно меньшими по размеру у мышей дикого типа (рис.3в). Эти результаты предполагают, что JunB поддерживает структурную целостность кожи, скорее всего, за счет одновременной тонкой настройки пролиферации и дифференцировки.

JunB был описан как белок, подавляющий опухоль, в более ранних отчетах ^14,27 . Таким образом, мы оценили, может ли JunB подавлять гиперпролиферацию эпидермиса, необходимую для инициации опухоли. Примечательно, что TPA, агент, инициирующий опухоль, сильно индуцировал гиперплазию не только в эпидермисе, но и в сальных железах JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа (рис.3d), тем самым подтверждая его антипролиферативные, возможно, опухолевые эффекты. Эти результаты согласуются с нашими более ранними выводами, показывающими активацию JunB после провокации TPA (рис. 1d).

Примечательно, что мы наблюдали значительно более высокую пролиферацию предшественников кератиноцитов, находящихся в базальном эпидермальном слое, и стволовых клеток LRIG1-положительной зоны соединения, что свидетельствует о предшественниках сальных желез в cKO JunB, в отличие от значительно меньшей пролиферации этих эпидермальных клеток в коже диких животных. тип мышей (дополнительные рисунки 6A и 6B).Поскольку микротравмы, вызванные выщипыванием волос, стимулировали экспрессию JunB в коже (Fig. 1c), мы задавались вопросом, коррелирует ли экспрессия JunB обратно с пролиферацией клеток. Совместное окрашивание на JunB и маркер пролиферации Ki67 после выщипывания волос на коже мышей дикого типа показало, что большинство пролиферирующих Ki67-положительных клеток, ограниченных базальным слоем или зоной роста волосяных фолликулов кожи мышей дикого типа, были явно отрицательными для JunB. (Дополнительный рисунок 6C и вставка на фиг. 3c). Напротив, экспрессия JunB наблюдалась в отрицательных по Ki67 клетках-потомках вблизи зоны роста волосяных фолликулов или в надбазальном слое эпидермиса кожи мышей дикого типа (дополнительный рисунок 6C и вставка на фиг.3в). Эти результаты подтверждают подавляющую роль JunB в пролиферации клеток-предшественников кожи.

Таким образом, наши результаты подчеркивают роль JunB в восстановлении гомеостаза кожи во время заживления ран и прогрессирования опухоли посредством жесткой регуляции эпидермальных предшественников и их дифференцированного потомства.

De novo образование сальных желез в эпидермисе ран JunB cKO

Чтобы определить судьбу и поведение базальных кератиноцитов и предшественников кератиноцитов JunB cKO во время регенерации кожи, мы наблюдали за заживлением ран в течение длительного периода 30 дней.Неожиданно мы наблюдали образование эктопических сальных желез, происходящих из регенерирующего эпидермиса раны в JunB cKO, что указывает на переключение в программе дифференцировки в субнаборе эпидермальных клеток-предшественников, лишенных JunB, что способствует спецификации сальных желез (Рис. 4a). Эти результаты были дополнительно подтверждены иммуноокрашиванием стеароил-КоА десатуразы-1 (SCD1), маркера, специфичного для сальных желез, в восстановленной раневой ткани сКО JunB через 30 дней после ранения. Себоциты детектировались как единичные клетки (рис.4b), как конгломерат нескольких себоцитов внутри эпидермиса (рис. 4c) или как целая сальная железа (рис. 4c), отражая разные стадии развития сальных желез у мышей JunB cKO. Несмотря на то, что недавно была описана временная изменчивость клонов в регенерирующем эпидермисе во время заживления ран ^11,28 , когда стволовые клетки волосяного фолликула или протока сальных желез покидают нишу и мигрируют к ложу раны, переключение пластичности в сторону себоцитов до сих пор не произошло. сообщил. Кроме того, чтобы определить, могут ли сальные железы de novo в долгосрочной перспективе образовывать волосяные фолликулы или опухоли сальных желез, мы наблюдали за ранами JunB cKO в течение 90 дней.Мы наблюдали, что de novo сальные железы далее удлинялись в трубчатый проток, лишенный каких-либо других кожных придатков (рис. 4d). Экспрессия Sox9 — установленный маркер стволовых клеток волосяного фолликула — была обнаружена во вновь образованных сальных железах и прилегающих к ним клетках, в отличие от ран у мышей дикого типа (дополнительная фигура 7A). Эта находка указывает на происхождение сальных желез de novo. Однако дальнейшие эксперименты по отслеживанию клонов, нацеленные на отдельные стволовые клетки кожи в сочетании с дефицитом JunB, необходимы для подтверждения этого вывода в будущих экспериментах.Интересно, что высокая экспрессия JunB наблюдалась практически в каждом кератиноците, присутствующем в регенерирующем эпидермисе раны мышей дикого типа, по сравнению с неповрежденной кожей (дополнительная фигура 7B). Более высокая экспрессия JunB, скорее всего, ограничивает пластичность субпопуляции предшественников кератиноцитов по отношению к сальным железам во время восстановления тканей (дополнительная фигура 7B). Вместе эти результаты указывают на то, что JunB играет важную роль в детерминации судьбы и регуляции пластичности стволовых клеток предшественников кератиноцитов и — при нарушении регуляции — ведет к дрейфу клонов, нарушению регенерации кожи и заживлению ран.

Рис. 4

Образование de novo сальных желез при ранениях JunB cKO. a Репрезентативные микрофотографии H&E 30-дневной ткани для восстановления ран, изображающие эктопические сальные железы у мышей JunB cKO. Вставка с увеличенным изображением. E, эпидермис; SG, сальная железа. Масштабные линейки 50 мкм. Количественная оценка количества сальных желез de novo в 30-дневных ранах. *** P <0,001, t -тест ( n = 3). Графический рисунок суммирует JunB-зависимое подавление дифференцировки эпидермальных предшественников по направлению к клонированию себоцитов (левая нижняя панель в противоположность клональной пластичности эпидермальных предшественников по отношению к дифференцировке себоцитов (правая нижняя панель). b , c Репрезентативные микрофотографии с иммуноокрашиванием SCD1 (красный), свидетельствующие о дифференцировке себоцитов, демонстрирующие различные стадии образования сальных желез de novo в 30-дневных ранах у мышей JunB cKO. Ядра окрашены DAPI в синий цвет. d Репрезентативные микрофотографии, показывающие образование удлиненного сального протока в эпителии раны 90-дневного возраста у мышей JunB cKO. Ткани раны окрашивали либо H&E, либо специфическим маркером сальных желез FABP5 (красный) и кератином K14, специфичным для базального слоя (зеленый).Ядра окрашены DAPI в синий цвет. Масштабные линейки 50 мкм. E, эпидермис; SG, сальная железа

Дефицит JunB изменил липидный профиль волос cKO

Поскольку сальные железы являются неотъемлемым компонентом волосяной единицы, обеспечивающей формирование полностью функциональных волос, мы исследовали, влияют ли на качество волос аномальные сальные железы JunB. cKO мышей. Сканирующая электронная микроскопия волосков JunB cKO продемонстрировала аномальную структуру с шероховатой и чешуйчатой ​​поверхностью по сравнению с гладкими и блестящими волосами мышей дикого типа (рис.5а), что свидетельствует о пагубных последствиях нарушения работы сальных желез для качества волос. Затем мы решили изучить возможность нарушения биосинтеза липидов кожного сала, обеспечивающих защитный гидрофобный барьер на волосах и внешней поверхности кожи. Действительно, GC-MS в сочетании с нецелевым HPLC-MS экстрактов волос выявила глобальный сдвиг в липидном составе JunB cKO по сравнению с мышами дикого типа (Fig. 5b-f).

Рис. 5

Существенно измененные компоненты кожного сала в волосах JunB cKO. a Сканирующие электронные микроскопические изображения демонстрируют неправильную структуру волос с шероховатой резной поверхностью у мышей JunB cKO, увеличение 2000 ×. Масштабные линейки 50 мкм. b Анализ главных компонентов (PCA), иллюстрирующий различия между различными группами образцов. c График вулкана, отображающий значительно измененные виды липидов между экстрактами волос мышей дикого типа и мышей JunB cKO. Цветовая шкала отражает нормализованные значения Log 2. d Комплексный анализ тепловой карты значительно измененных видов липидов между экстрактами волос мышей дикого типа и мышей JunB cKO.Цветовая шкала (от синего до красного) отражает значения Log 2, а цветовая шкала (от розового до фиолетового) показывает время удерживания в анализе ЖХ-МС, указанное в минутах. e ГХ-МС анализ экстрактов волос взрослых мышей дикого типа и мышей JunB cKO, показывающий виды липидов, участвующих в биосинтезе холестерина, или f различных классов свободных жирных кислот. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ( n = 3), t-критерий. Верхняя граница прямоугольника обозначает 3-й квартиль, а нижняя граница — 1-й квартиль.Средняя линия представляет собой среднее значение, а усы представляют максимальное и минимальное значения.

Ненаправленная ВЭЖХ-МС продемонстрировала существенные различия в несмещенных полных профилях липидов между экстрактами волос cKO дикого типа и JunB (рис. 5b – d). Анализ графика вулканов, по сути, выявил 46 различных биосинтезированных липидных единиц между экстрактами волос дикого типа и JunB cKO, среди них 26 с более чем двукратным изменением (рис. 5c). Анализ тепловой карты видов липидов, модифицированных со кратностью изменения ≥ 2, выявил существенное снижение содержания ацилкарнитина (пальмитоил- и олеоилкарнитин), эндоканнабиноидов (пальмитоил-, олеоил- и стеароилэтаноламид) в экстрактах волос JunB cKO по сравнению с экстрактами волос дикого типа (рис. .5г). Насколько нам известно, ранее не сообщалось ни о секреции ацилкарнитина и эндоканабиноидов, ни об их JunB-зависимом снижении кожного сала мышей. Идентичность ацилкарнитина и эндоканнабиноидов, несущих головные группы карнитина и этаноламина (EA), соответственно, была подтверждена сравнением спектров МС / МС с аутентичными соединениями и спектрами in silico, доступными в базе данных метаболома человека (http: //www.hmdb. ca /). Кроме того, мы проанализировали данные ЖХ-МС для липидных соединений, несущих ЕА, которые включают время удерживания (RT), аннотации, элементную формулу, ионизацию и результаты эксперимента МС / МС для обнаруженных членов семейства EA (дополнительная таблица 1 ).Фрагментация исходных ионов 538, 552 и 566 генерировала фрагменты 300, 282 и 62, которые перекрывали особенности спектра пальмитоил-EA MS / MS (дополнительная таблица 1). Точно так же фрагменты, общие для олеоил-EA, генерировались из родительских ионов 590 и 592, тогда как фрагменты стеароил-EA генерировались из 564, 566, 592 и 594 исходных ионов (дополнительная таблица 1). Таким образом, спектры ионов 566 и 592 показали, что каждый из них, по-видимому, присутствует в двух основных изоформах.Как показано на фиг. 5d, уровни ацилкарнитина, эндоканнабиноидов, соединений, родственных EA, и церамидов были значительно снижены у мышей JunB cKO.

Кроме того, в отличие от экстрактов волос дикого типа, мы наблюдали значительное снижение концентраций холестерина и десмостерина со значительным увеличением вышестоящих метаболитов, таких как холест-7,24-диен-3β-ол и ланостерин в JunB cKO. (Рис. 5e). Эти данные свидетельствуют о серьезном нарушении биосинтеза холестерина, скорее всего, из-за нарушения ответственных путей Kandutsch-Russel и Bloch в сальных железах JunB cKO ²⁹ .Более того, биосинтез свободных жирных кислот также был затронут в волосах JunB cKO, поскольку анализ экстрактов волос методом ГХ-МС выявил значительное снижение C16: 0 и C18: 1, в то время как значительное увеличение концентрации свободных жирных кислот C20: 0 и C21: 0 по сравнению с экстрактами волос дикого типа (фиг. 5f).

Таким образом, мы наблюдали серьезно нарушенный биосинтез компонентов кожного сала, отражающий функциональные нарушения сальных желез, которые в сочетании с нарушенной дифференцировкой и стойким воспалением способствуют дисфункции кожного барьера и наблюдаемой патологии волос у мышей JunB cKO.

Глобально измененный профиль экспрессии генов в коже JunB cKO

Для всесторонней оценки глобальных изменений экспрессии генов в нормальных, а также в стрессовых условиях, таких как ранение и выщипывание волос, была проведена транскриптомная обработка дорсальной кожи эпидермальных мышей JunB cKO и мышей дикого типа. Анализ РНК-seq выявил значительные различия в экспрессии генов между JunB cKO и неповрежденной кожей дикого типа или кожей, полученной после ранения и выщипывания волос, соответственно (фиг. 6a, b, дополнительные рисунки 8A и 8B).Как и ожидалось, мы наблюдали заметное увеличение провоспалительных генов в ранах JunB cKO по сравнению с ранами дикого типа. Значительное усиление путей, вовлеченных в передачу сигналов цитокинов и хемокинов, а также ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) было обнаружено с помощью анализа обогащения путей в ранах JunB cKO (Fig. 6a, c). Депиляция волос — это скорее способствующее развитию состояние с меньшим количеством воспалений. Среди других путей особенно интригующей была активация «передачи сигналов Notch» (рис.6c, d) поскольку каноническая передача сигналов Notch является основным регулятором дифференцировки эпидермиса ⁶ , которая может запускать аберрантную дифференцировку в коже JunB cKO. Мы также подтвердили участие Notch на уровне белка. Вестерн-блоттинг показал существенную активацию Notch и его целевые белки, такие как p21, CyD3 и cMyc, в коже JunB cKO в ответ на выщипывание волос, в отличие от кожи дикого типа (фиг. 6e, дополнительная фигура 9A и дополнительная фигура 12). Кроме того, анализ РНК-seq — в невозмущенных условиях — также выявил значительные различия в экспрессии генов между JunB cKO и кожей дикого типа (выделенной из кожи спины 60-дневных мышей) (дополнительные рисунки 8A и 8B).Среди прочего, мы выявили значительное снижение количества генов, участвующих в липидном метаболизме сальных желез (дополнительный рисунок 8C), наиболее вероятно влияющих на синтез липидов и созревание сальных желез, что согласуется с нашими более ранними липидомными данными (рис. 5b-f). . Кроме того, иммуноокрашивание Awat2 — ключевого фермента в синтезе парафина, локализованного в зрелых сальных железах — показало значительно сниженную экспрессию у мышей JunB cKO (дополнительный рисунок 8G). Напротив, гены, участвующие в синтезе муцина, такие как MUC1 , MUC 2 , MUC 4, и MUC 6 , были сильно активированы у мышей JunB cKO (дополнительная фигура 8C).В случае генов семейства Wnt , которые являются основными детерминантами стволового эпидермиса в коже, значительно увеличилась экспрессия Wnt5b , 7a , 8b , 9a и 9b в первичном эпидермальном предшественнике JunB cKO. клеток (дополнительная фигура 8D). Дефицит JunB также модулировал экспрессию генов Notch (дополнительная фигура 8E) и нескольких медиаторов воспаления (дополнительная фигура 8F). Следует отметить, что мы обнаружили заметное изменение экспрессии других факторов транскрипции сборки AP-1 в коже JunB cKO (рис.6e и дополнительный рисунок 9A). Это означает, что JunB играет решающую роль в стабильности или наиболее вероятной активности других членов комплекса AP-1.

Рис. 6

Дефицит JunB значительно изменил глобальный транскриптом. a , b Тепловая карта, отображающая транскриптомное профилирование образцов ( n = 3) из кожи дикого типа и кожи JunB cKO, собранных после ранения или выщипывания волос. Цвет отражает шкалу относительного выражения log2, как в случае на рисунке ( a , b и d ). c Анализ обогащения путей, показывающий высокоактивные пути в коже мышей JunB cKO по сравнению с диким типом после ранения или выщипывания волос. Пунктирная линия соответствует значению P , равному 0,05. P <0,05 для обогащения пути считали значимым. d Тепловая карта, изображающая гены, участвующие в передаче сигналов Notch из кожи дикого типа и JunB cKO, собранные после выщипывания волос. e Вестерн-блот-анализ ключевых белков активированного пути Notch и членов AP-1 через 4 дня после выщипывания волос в JunB cKO и коже дикого типа. f Распределение сигналов ATAC-seq по телу гена всего генома мыши и g высокое обогащение мотива AP-1 как в первичных эпидермальных клетках-предшественниках, выделенных из JunB cKO, так и в коже дикого типа после выщипывания волос. ч. Анализ ChIP из эпидермальных клеток-предшественников дикого типа, выделенных после депиляции волос, показывает различные сайты связывания JunB в промоторных областях Notch2 и i Notch5 . Кратность обогащения рассчитывается путем сравнения значений Ct каждого набора праймеров (сайт связывания JunB / AP1) с отрицательной областью JunB / AP1 (3′-UTR в случае Notch2 и 5′-UTR в случае Notch5 ).Каждое из значений Ct либо сайтов связывания JunB / AP1, либо отрицательной области вычитали из соответствующих значений Ct IgG ( n = 3), * P <0,05, *** P <0,001, t — контрольная работа. Положение мотива (сайт связывания JunB) указано на оси X. Схематическое изображение сайтов связывания JunB / AP1 (красная полоса) в промоторной области гена Notch2 или Notch5 представлено над графиками. экспрессии генов и доступности ген-регуляторных участков хроматина использовали анализ хроматина, доступного для транспозаз, с анализом высокопроизводительного секвенирования (ATAC-seq).Сигналы ATAC-seq от эпидермальных клеток-предшественников, выделенных либо от JunB cKO, либо от мышей дикого типа после выщипывания волос, были картированы по всей геномной области, чтобы обнаружить влияние дефицита JunB на состояние хроматина. Было обнаружено заметное обогащение сигналов ATAC-seq в сайтах старта транскрипта (TSS) в эпидермальных клетках-предшественниках JunB cKO в отличие от клеток дикого типа (фиг. 6f, дополнительные рисунки 10A и 10B), которые, скорее всего, влияют на глобальную транскрипцию генов. Интересно, что анализ ATAC-seq показал, что мотив AP-1 был одним из наиболее обогащенных доменов открытого хроматина как в коже JunB cKO, так и в коже мышей дикого типа после выщипывания волос (рис.6г). Кроме того, анализ мотива ATAC-seq de novo у мышей JunB cKO выявил заметное обогащение мотива AP-1 как в генах с повышенной, так и с пониженной регуляцией (дополнительная фигура 9B), предполагая ключевую регуляторную роль AP-1 в поддержании эпидермального гомеостаза. В соответствии с нашими выводами, анализ ATAC-seq ранее депонированных данных, GEO: GSE89928 ¹¹ , выявил значительное обогащение AP-1 во время заживления эпидермальных ран (24,55%) по сравнению с гомеостатическими эпидермальными (15.31%) и стволовые клетки HF (4,73%) (дополнительный рисунок 9C).

Поскольку путь Notch сильно активирован у мышей JunB cKO, мы дополнительно исследовали, взаимодействует ли JunB с промоторными областями Notch. Анализ In-silico действительно выявил потенциальные сайты связывания JunB в промоторной области нескольких генов семейства Notch (дополнительная фигура 10C). Впоследствии были выполнены анализы ChIP для определения прямого физического взаимодействия между JunB и промотором Notch в эпидермальных клетках-предшественниках дикого типа в ответ на выщипывание волос.Следует отметить, что подтверждены множественные сайты связывания для JunB в промоторной области Notch 1 (фиг. 6h) и Notch 4 гена (фиг. 6i), что указывает на прямую регуляцию передачи сигналов Notch с помощью JunB в эпидермисе. Следует отметить, что анализ ChIP-qPCR продемонстрировал снижение репрессивных гистоновых меток (h4K27Me3 и h4K9Me3) и увеличение активных гистоновых меток (h4K9Ac и h4K4Me) в промоторной области гена Notch2 и Notch5 в базальном эпидермальном гене JunB cKO. клетки-предшественники по сравнению с контролем (дополнительные фигуры 11A и 11B).

В совокупности наши результаты ясно показывают, что JunB важен для поддержания, а также ограничения судьбы отдельных стволовых клеток и клеток-предшественников, находящихся в коже.

Ингибирование Notch восстановило гомеостаз кожи у JunB cKO.

Для дальнейшего изучения того, является ли повышенная регуляция передачи сигналов Notch у мышей JunB cKO причиной наблюдаемого дрейфа клонов и нарушения функции кожи, мы использовали фармакологический подход для ингибирования передачи сигналов Notch у мышей JunB cKO. Мы повторно лечили мышей JunB cKO либо носителем, либо ингибитором гамма-секретазы дибензазепином (DBZ, 1 мг / кг) ³⁰ , специфическим ингибитором Notch (рис.7а). Гамма-секретаза облегчает заключительную стадию расщепления предшественника Notch и тем самым активирует передачу сигналов Notch. Используя DBZ во время заживления ран, мы исследовали пластичность клонов, дифференцировку, пролиферацию и барьерную функцию у мышей JunB cKO.

Рис. 7

Ингибирование Notch восстанавливает эпидермальный гомеостаз в cKO JunB. a Мультфильм, изображающий экспериментальный план и схему введения ингибитора Notch DBZ или носителя у мышей JunB cKO. b Репрезентативное окрашивание H&E и иммуноокрашивание c на специфический для сальных желез маркер FABP5 демонстрирует отсутствие образования сальных желез de novo в новообразованном эпителии ран у мышей JunB cKO, обработанных ингибитором Notch DBZ, по сравнению с группой, обработанной носителем ( n = 3).Масштабные линейки 50 мкм. d Репрезентативные микрофотографии с иммуноокрашиванием маркера дифференцированных кератиноцитов K10 (красный) и маркера недифференцированных кератиноцитов K14 (зеленый) у мышей JunB cKO, получавших DBZ, по сравнению с группой, получавшей носитель ( n = 3). Ядра окрашены DAPI в синий цвет. Масштабные линейки 50 мкм. e Репрезентативные микрофотографии с иммуноокрашиванием маркера пролиферации Ki67 (зеленый) и FABP5 (красный) и количественным определением f у мышей JunB cKO, обработанных DBZ, в отличие от группы, обработанной носителем.*** P <0,001, t -тест ( n = 3). Ядра окрашены DAPI в синий цвет. Масштабные линейки 50 мкм. г TEWL, который обратно связан с функцией эпидермального барьера, измеряли на дорсальной коже мышей JunB cKO, обработанных DBZ, и в группе, обработанной носителем ( n = 3). *** P <0,001, t -тест

Интересно, что полное отсутствие эктопических сальных желез было обнаружено в регенерирующем эпителии раны в группе, получавшей DBZ, по сравнению с мышами JunB cKO, получавшими носитель (рис.7б, в). Вместо этого DBZ-обработанные JunB cKOs обнаруживают тонкий эпителий рубца и присутствие кератиновых кист, которые обычно обнаруживаются у Notch-дефицитных мышей ³¹ . Эти данные подтверждают эффективную блокаду Notch с помощью DBZ в нашей модельной системе (рис. 7b, c). Это было дополнительно подтверждено на уровне белка (дополнительная фигура 11C). Кроме того, хроническое введение DBZ восстановило экспрессию маркера терминальной дифференцировки K10 и ограничило экспрессию маркера K14 недифференцированных кератиноцитов базальным слоем в коже JunB cKO по сравнению с группой, обработанной носителем (рис.7г). В соответствии с этими результатами ингибирование Notch снижает пролиферацию эпителиальных клеток в коже JunB cKO, о чем свидетельствует заметное снижение маркера пролиферации Ki67 (фиг. 7e, f). Чтобы изучить, может ли длительная блокада Notch восстановить барьерную функцию в коже JunB cKO, измерения TEWL были выполнены на коже спины мышей. У мышей, получавших DBZ, было обнаружено значительное снижение TEWL по сравнению с группой, получавшей носитель (фиг. 7g). Эти данные свидетельствуют о заметном восстановлении нарушенной барьерной функции в коже JunB cKO.

В совокупности наши результаты показали положительное действие ингибирования Notch на кожу JunB cKO, которое не только препятствует дрейфу клонов, но также восстанавливает эпидермальный гомеостаз и функцию кожи.

Структурные детерминанты гомодимерного комплекса IRF4 / ДНК | Исследование нуклеиновых кислот

12″ data-legacy-id=»SEC1″> ВВЕДЕНИЕ

Факторы регуляции интерферона (IRF) — это семейство регуляторов транскрипции, которые обеспечивают множество функций, включая дифференцировку и развитие гематопоэтических клеток, регуляцию апоптоза и защиту хозяина от патогенов (1–5). Семейство состоит из девяти членов (IRF1 – IRF9) и обычно распознает промоторы, состоящие из консенсусной последовательности IRF 5′-GAAA-3 ‘(6). Среди этих членов IRF4 считается уникальным из-за его ограниченной экспрессии в иммунных клетках, таких как лимфоциты и дендритные клетки.Более того, IRF4 — единственный член IRF, который не регулируется интерферонами (IFN) (7). В В- и Т-клетках IRF4 экспрессируется на нескольких стадиях их развития, влияя на дифференцировку, клональную экспансию и клеточный исход (7-11). Из-за своей критической роли в развитии B-клеток неудивительно, что IRF4 напрямую связан с иммунными заболеваниями, включая B-клеточно-специфический хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и множественную миелому (MM). Действительно, полногеномный анализ пациентов с ХЛЛ выявил IRF4 как сильного кандидата на предрасположенность к заболеванию (12).Кроме того, было идентифицировано несколько повторяющихся соматических мутаций IRF4, которые непосредственно участвуют в патогенезе ХЛЛ (13,14). Сходным образом мутации в IRF4 были обнаружены у редких пациентов с MM (15-17), при этом обнаружено, что злокачественные клетки в MM сильно зависят от IRF4 (18). Вместе эти наблюдения делают IRF4 привлекательной целью для разработки новых методов лечения этих болезненных состояний. Однако, как эти мутации влияют на функцию IRF4 и его роль в развитии заболеваний CLL и MM, остается нерешенным.

IRF4 состоит из двух структурных доменов: высококонсервативного N-концевого ДНК-связывающего домена (DBD) и вариабельного C-концевого ассоциативного домена IRF (IAD), соединенных гибким линкером (7,19) (рис. 1A). DBD характеризуется пятью консервативными триптофанами, позволяющими ему формировать мотив спираль-петля-спираль, который облегчает связывание ДНК (20). IAD представляет собой домен межбелкового взаимодействия, который опосредует не только гомо и гетеродимерные взаимодействия между IRF, но также ассоциацию с множеством различных факторов транскрипции (TF).Примечательно, что IAD также содержит C-концевую аутоингибиторную область (AR), которая напрямую связывает DBD и модулирует его взаимодействие с целевой ДНК (19,21,22).

Рисунок 1.

Обзор ДНК-связывающего домена IRF4. ( A ) Схематическое изображение ДНК-связывающего домена IRF4. Панель ( B ) отображает выравнивание ДНК-связывающего домена человека IRF4 с его соответствующими членами семейства IRF. Выше показаны последовательности расположения элементов вторичной структуры, включающих α-спирали (α1 – α3), β-листы (β1 – β4) и соединительные петли (L1 – L3).

Рисунок 1.

Обзор ДНК-связывающего домена IRF4. ( A ) Схематическое изображение ДНК-связывающего домена IRF4. Панель ( B ) отображает выравнивание ДНК-связывающего домена человека IRF4 с его соответствующими членами семейства IRF. Выше показаны последовательности расположения элементов вторичной структуры, включающих α-спирали (α1 – α3), β-листы (β1 – β4) и соединительные петли (L1 – L3).

Неудивительно, что благодаря своей универсальной функции были идентифицированы многочисленные ДНК-мишени для взаимодействия с IRF4 (10).Он связывает канонические элементы ответа, стимулированные интерфероном (ISRE), в качестве гомодимера и регулирует активацию генов, стимулированных интерфероном (ISG). И наоборот, он задействует специфические трансформации эритробластов (Ets), композиционные элементы интерферона (EICE) и композитные элементы AP-1-IRF (AICE1 или 2) в качестве гетеродимера и требует ТФ PU.1, SPIB или BATF для его высокоаффинного взаимодействия ( 7). Примечательно, что выбор образования гетеродимерного комплекса во многом зависит от типа клетки-мишени и важен для клеточного исхода.Связывание IRF4 с ТФ ETS в значительной степени ограничено В-клетками и дендритными клетками, тогда как гетеродимерный комплекс, образованный между ТФ IRF4 и AP-1, является основным комплексом в Т-клетках (23), но также имеет значение во время В-клеток и плазмы зародышевого центра. клеточная регуляция.

IRF4 является ключевым регулятором динамики судьбы В-клеток при встрече с антигеном. Примечательно, что он играет важную роль в дифференцировке плазматических клеток, что он и делает, взаимодействуя преимущественно с локусом Prdm1 , кодирующим фактор транскрипции Blimp1 (24,25).Было показано, что высокая экспрессия IRF4 в GC B-клетках приводит к активации Blimp-1 и образованию плазматических клеток (25). Однако другое исследование показало, что Blimp-1 активируется даже в отсутствие IRF4, но этого недостаточно для индукции программы плазматических клеток, зависимой от Blimp-1, что предполагает взаимодействие Blimp-1 и IRF4 для дифференцировки плазматических клеток (26). . Исследования сшивания хроматина и иммунопреципитации (ChiP) подтвердили, что IRF4 связывает консервативную некодирующую последовательность 9 (CNS-9) в локусе Prdm1 (кодирующий Blimp-1), и идентифицировали 5′-CAACTGAAACCGAGAAAGC-3 ‘ISRE ДНК как одну из чрезмерно представленные целевые последовательности (24,25).Исследование также показывает, что он задействует вышеупомянутую последовательность как гомодимер с более низким сродством, чем гетеродимер, и что это взаимодействие с ISRE является ключевым фактором, искажающим программу развития В-клеток в сторону дифференцировки плазматических клеток (24).

Большая часть работ по биохимическим и структурным основам кооперативного связывания между IRF4 и др. TFs была предпринята на комплексе IRF4-ДНК-PU.1 (21,27,28). Эти исследования идентифицировали две различные сети белок-белковых взаимодействий для образования гетеродимерных комплексов — одну между DBDs IRF4 и PU.1, а другой основан на взаимодействии между PEST-областью PU.1 и IAD IRF4. Хотя PU.1 сам по себе может связывать составной элемент, рекрутирование IRF4 в ДНК-связанную ДНК облегчается фосфорилированной областью PEST, которая, взаимодействуя с IRF4-IAD, снимает аутоингибирование, связанное с прямым связыванием AR к IRF4 – DBD. Сходным образом взаимодействие между IRF4 с BATF / c-jun или BATF / JunB следует аналогичному партнеру зависимому паттерну связывания, где область лейциновой молнии BAFT участвует в рекрутировании IRF4 на мотив AICE (29,30).Несмотря на подробные знания о гетеродимерных взаимодействиях IRF4, неизвестно, как IRF4 взаимодействует с ДНК в качестве гомодимера, чтобы регулировать клеточный результат ISGs. Ключевые вопросы, которые остаются, включают в себя, как оба ДНК-связывающих домена IRF4 взаимодействуют друг с другом, чтобы облегчить взаимодействие ДНК, и почему связывание гомодимера IRF4 с ДНК по своей природе слабее, чем связывание его гетеродимерного аналога.

Чтобы изучить молекулярные основы взаимодействия гомодимера IRF4 / ДНК и очертить стереохимические различия между гомодимерными и гетеродимерными комплексами IRF4, мы совместно кристаллизовали ДНК-связывающий домен IRF4 с ДНК ISRE (5′-CAACTGAAACCGAGAAAGC-3 ‘), Содержащий две перекрывающиеся консенсусные последовательности распознавания IRF (GAAA), и определяющий структуру тройного комплекса.Наше исследование показывает, что IRF4 связывает ДНК, существенно искажая ее структуру, чтобы приспособиться к уникальному способу связывания соседних сайтов связывания IRF4. Кроме того, в отличие от гетеродимерного комплекса, межмолекулярных взаимодействий между взаимодействующими ДНК-связывающими доменами не наблюдалось. Выяснение структуры комплекса гомодимер IRF4 / ДНК обеспечивает молекулярную основу для функциональных эффектов мутаций IRF4, наблюдаемых у пациентов с ХЛЛ (13).

21″ data-legacy-id=»SEC2-1″> Экспрессия и очистка

Оптимизированные по кодонам конструкции гена IRF4 DBD были клонированы в p ^J411KanR (ATUM) и сверхэкспрессированы в виде N-концевого слитого с тегом белка His ₆ в Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) в 16 ° C после индукции с 0.5 мМ IPTG в среде 2X YT. Клетки ресуспендировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7,0), 500 мМ NaCl и 30 мМ имидазоле (буфер A) с коктейлем ингибиторов протеаз (Sigma), 3 мМ β-меркаптоэтанола и лизировали во французской прессе (1500 фунтов на квадратный дюйм). Лизат центрифугировали при 15 000 об / мин в течение 30 минут, и мутантные белки WT и IRF4 очищали с использованием 5 мл колонки HisTrap (Cytiva) в буфере А с градиентом имидазола 30–500 мМ. Для расщепления His-метки элюированные фракции объединяли и подвергали расщеплению HRV3c в течение ночи при 4 ° C в буфере A.Расщепленные His-tag белки IRF4 впоследствии загружали и очищали, пропуская через колонку HisTrap (Cytiva). Очищенный белок Ni-NTA подвергали диализу в 20 мМ Трис-буфере (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP и затем очищали эксклюзионной хроматографией (SEC) с использованием гель-фильтрационной колонки superdex 200 16/600 (Cytiva).

Для образования и очистки внутримолекулярных комплексов IRF4 / ДНК очищенный SEC IRF4 ^WT инкубировали с ДНК ISRE (Integrated DNA technologies) в соотношении 1: 0.5 в течение ночи при 4 ° C. Комплекс гомодимер IRF4 ^WT -ISRE был выделен и очищен путем инъекции образца в колонку для гель-фильтрации superdex 200 16/600. Параллельно IRF4 ^WT в отсутствие ДНК очищали в идентичной среде для сравнения профиля элюции SEC.

26″ data-legacy-id=»SEC2-3″> Поверхностный плазмонный резонанс

Измерения аффинности выполняли при 20 ° C на Biacore 8K (Cytiva) с буфером HBS (10 мМ HEPES-HCl, pH 7,4 и 150 мМ NaCl) с добавлением 3 мМ ETDA и 0,05% P20 в качестве рабочего буфера. Биотинилированные мотивы ДНК (ISRE, EICE1, AICE1 и AICE2; дополнительная таблица S1) (интегрированные технологии ДНК) были присоединены (до ~ 2000 RU) к чипу серии S со стрептавидином (SA) (Cytiva) в соответствии с инструкциями производителя.Измерение аффинности проводили путем пропускания последовательно увеличивающихся концентраций IRF4 ^WT , IRF4 ^L116R , IRF4 ^K59A и IRF4 ^Y62A (до 5 мкМ) при скорости потока 30 мкл / мин. Конечная единица отклика рассчитывалась путем вычитания единицы отклика, полученной из эталонной проточной кюветы. Данные о стационарном сродстве мультициклов были подогнаны с использованием программного обеспечения Biacore 8K BIAevaluation. Для представления данных использовалась GraphPad Prism Version 8.0.

29″ data-legacy-id=»SEC3-1″> Совместное комплексообразование и определение структуры

Эксклюзионную хроматографию использовали для однозначного выделения и очистки гомодимера IRF4 / ISRE. ДНК-связывающий домен апо IRF4 (молекулярная масса ~ 13 кДа) начал элюцию в объеме ~ 90 мл, что соответствует ожидаемому профилю элюирования мономера. И наоборот, когда белок инкубировали с ДНК и разделяли в тех же условиях, IRF4 / ДНК начинали элюировать в объеме ~ 80 мл, что соответствует молекулярной массе белка ~ 40 кДа (дополнительный рисунок S1).Ожидаемая молекулярная масса димера IRF4, связанного с ISRE, составляет ~ 38 кДа, что позволяет предположить, что, как и ожидалось, комплекс IRF4 / ISRE элюируется в этом объеме в виде гомодимера.

Чтобы определить структурную основу образования гомодимерного комплекса IRF4 / ДНК, мы сокристаллизовали ДНК-связывающий домен IRF4, содержащий остатки от 21 до 130 аминокислот, с ДНК ISRE. Сложные кристаллы дифрагировали до 2,95 Å и принадлежали к пространственной группе P3 ₁ 2 1 с размерами элементарной ячейки a = 117.8, b = 117,8, c = 154,58 и α = 90 °, β = 90 °, γ = 120 °. Мы определили структуру путем молекулярного замещения и уточнили ее до конечных R _{рабочих} и R _{свободных} 18,5% и 20,5%, соответственно (Таблица 1). В асимметричном звене кристаллическая структура содержала четыре ДНК-связывающих домена IRF4, а именно IRF4-A (21–129), IRF4-B (23–129), IRF4-G (21–129) и IRF4-H (21–129). 128) и два дуплекса ДНК, соответственно, представляющие два гомодимерных тройных комплекса IRF4 / ДНК.Кроме того, дуплекс ДНК в кристаллической структуре был стабилизирован взаимодействием стэкинга с другими комплексами, связанными с симметрией, с образованием непрерывной спирали ДНК в кристалле. Два гомодимерных комплекса внутри асимметричного звена были по существу идентичными (среднеквадратичное отклонение 0,207 Å для всех атомов углерода Cα). Более того, взаимодействующая субъединица гомодимера демонстрирует минимальные структурные изменения со среднеквадратичным отклонением 0,305 Å для всех атомов углерода Cα, и поэтому для последующих анализов мы использовали гомодимерный комплекс, который включал IRF4 (цепи A и B) и ДНК (цепь D и E).

Таблица 1.

Статистика сбора и уточнения данных

Длина волны .	.
Диапазон разрешения	48,44–2,95 (3,055) 2,95)
Пространственная группа	P 31 2 1
Единичная ячейка	117,802 117,802 154,579 90 90 120
Полное отражение	295918 (26403)
Уникальные отражения	26659 (2492)
Множественность	11.1 (10,1)
Полнота (%)	99 (100)
Среднее значение I / сигма (I)	19,23 (1,82)
B-фактор Вильсона	76,67
R-слияние	0,1054 (1,251)
R-средство	0,1106 (1,318)
CC1 / 2	0,999 (0,692)
CC *	1 (0,904)
Отражения, используемые в доработке	26532 (2491)
Отражения, используемые для без R	1320 (125)
R-работа	0.1848 (0,3318)
R бесплатно	0,2055 (0,3460)
CC (рабочий)	0,966 (0,719)
CC (бесплатно)	0,960 (0,753)
Номер неводородных атомов	5204
макромолекул	5204
Белковые остатки	433
RMS (связи)	0,004
RMS (углы)	0.90
Рамачандран одобрен (%)	95
Рамачандран разрешен (%)	4,7
Выбросы Рамачандрана (%)	0
Выбросы Ротамера (%)	0
Clashscore	1,55
Средний B-фактор	76,66
макромолекулы	76,66
Количество TLS-групп	31

Длина волны .	.
Диапазон разрешения	48,44–2,95 (3,055) 2,95)
Пространственная группа	P 31 2 1
Единичная ячейка	117,802 117,802 154,579 90 90 120
Полное отражение	295918 (26403)
Уникальные отражения	26659 (2492)
Кратность	11,1 (10,1)
Полнота (%)	99 (100)
Среднее значение I / сигма (I)	19.23 (1,82)
B-фактор Вильсона	76,67
R-слияние	0,1054 (1,251)
R-средство	0,1106 (1,318)
CC1 / 2	0,999 (0,692)
CC *	1 (0,904)
Отражения, используемые при уточнении	26532 (2491)
Отражения, используемые для без R	1320 (125)
Р-рабочий	0.1848 (0,3318)
R бесплатно	0,2055 (0,3460)
CC (рабочий)	0,966 (0,719)
CC (бесплатно)	0,960 (0,753)
Номер неводородных атомов	5204
макромолекул	5204
Белковые остатки	433
RMS (связи)	0,004
RMS (углы)	0.90
Рамачандран одобрен (%)	95
Рамачандран разрешен (%)	4,7
Выбросы Рамачандрана (%)	0
Выбросы Ротамера (%)	0
Clashscore	1,55
Средний B-фактор	76,66
макромолекул	76,66
Количество TLS-групп	31

Таблица 1.

Статистика сбора и уточнения данных

Длина волны .	.
Диапазон разрешения	48,44–2,95 (3,055) 2,95)
Пространственная группа	P 31 2 1
Единичная ячейка	117,802 117,802 154,579 90 90 120
Полное отражение	295918 (26403)
Уникальные отражения	26659 (2492)
Множественность	11.1 (10,1)
Полнота (%)	99 (100)
Среднее значение I / сигма (I)	19,23 (1,82)
B-фактор Вильсона	76,67
R-слияние	0,1054 (1,251)
R-средство	0,1106 (1,318)
CC1 / 2	0,999 (0,692)
CC *	1 (0,904)
Отражения, используемые в доработке	26532 (2491)
Отражения, используемые для без R	1320 (125)
R-работа	0.1848 (0,3318)
R бесплатно	0,2055 (0,3460)
CC (рабочий)	0,966 (0,719)
CC (бесплатно)	0,960 (0,753)
Номер неводородных атомов	5204
макромолекул	5204
Белковые остатки	433
RMS (связи)	0,004
RMS (углы)	0.90
Рамачандран одобрен (%)	95
Рамачандран разрешен (%)	4,7
Выбросы Рамачандрана (%)	0
Выбросы Ротамера (%)	0
Clashscore	1,55
Средний B-фактор	76,66
макромолекулы	76,66
Количество TLS-групп	31

Длина волны .	.
Диапазон разрешения	48,44–2,95 (3,055) 2,95)
Пространственная группа	P 31 2 1
Единичная ячейка	117,802 117,802 154,579 90 90 120
Полное отражение	295918 (26403)
Уникальные отражения	26659 (2492)
Кратность	11,1 (10,1)
Полнота (%)	99 (100)
Среднее значение I / сигма (I)	19.23 (1,82)
B-фактор Вильсона	76,67
R-слияние	0,1054 (1,251)
R-средство	0,1106 (1,318)
CC1 / 2	0,999 (0,692)
CC *	1 (0,904)
Отражения, используемые при уточнении	26532 (2491)
Отражения, используемые для без R	1320 (125)
Р-рабочий	0.1848 (0,3318)
R бесплатно	0,2055 (0,3460)
CC (рабочий)	0,966 (0,719)
CC (бесплатно)	0,960 (0,753)
Номер неводородных атомов	5204
макромолекул	5204
Белковые остатки	433
RMS (связи)	0,004
RMS (углы)	0.90
Рамачандран одобрен (%)	95
Рамачандран разрешен (%)	4,7
Выбросы Рамачандрана (%)	0
Выбросы Ротамера (%)	0
Clashscore	1,55
Средний B-фактор	76,66
макромолекулы	76,66
Число TLS-групп	31

37″ data-legacy-id=»SEC3-3″> IRF4 проявляет минимальную структурную пластичность при связывании

ЯМР-структура ДНК-связывающего домена апо IRF4 (PDB: 2DLL) позволила нам сравнить конформационные перестройки ДНК-связывающего домена при взаимодействии с ДНК.Суперпозиция самой низкоэнергетической модели структуры ЯМР IRF4 с нашей гомодимерной структурой дала среднеквадратичное отклонение ∼1,2 Å для всех атомов. Поскольку IRF4 тесно взаимодействует с консенсусной последовательностью ДНК через спираль узнавания α3, конформационные изменения в этой спирали специально сравнивались между ДНК-связанным и ДНК-связывающим доменом апо IRF4, что приводило к отклонению RMS на ∼0,623 Å. Примечательно, что кроме соединительной петли L1 (∼2,8 Å) (дополнительный рисунок S2), другие петли показали лишь незначительные различия в их ориентации без каких-либо серьезных структурных перестроек (среднеквадратичное отклонение <1.5 Å). Конформационные перестройки в соединительной петле L1 также сравнивали как в гомо-, так и в гетеродимерных комплексах IRF4, и было обнаружено, что отклонение RMS составляет ∼3,49 Å. Это говорит о том, что соединительный контур L1 по своей природе является гибким и подробно обсуждается ниже. Взятые вместе, эти данные показывают, что за исключением соединительной петли L1, ДНК-связывающий домен IRF4 подвергается минимальной структурной перестройке при взаимодействии с целевой ДНК с минимальными энтропийными затратами.

44″ data-legacy-id=»SEC3-5″> IRF4 – ДНК взаимодействия

ДНК-связывающий домен IRF4 преимущественно взаимодействует с ДНК через серию контактов фосфатного остова, позволяя позиционировать спираль α3 в большой бороздке и соединять петлю L1 в малой бороздке (рис. 5А). Взаимодействие с обеими последовательностями узнавания IRF (GAAA) происходит из С-концевой области спирали α3.В частности, для B-цепи IRF4 эти взаимодействия в основном опосредуются Arg 98, Cys 99, Asn 102 и Lys 103. Вкратце, Arg 98 широко взаимодействует с первым основанием гуанина, контактируя с основанием через водородную связь. Распознаванию второго основания способствует Cys 99, через который сульфгидрильная группа образует водородную связь с N6 основания аденина. Кроме того, он также взаимодействует как со вторым, так и с третьим основанием через контакты Ван-дер-Ваальса. Контакт Asn 102 в первую очередь обеспечивается водородной связью с OP2 первого основания.Присутствие Lys 103, которое ограничено несколькими членами IRF, взаимодействует с четвертым основанием последовательности узнавания преимущественно за счет образования опосредованного Ван-дер-Ваальса контакта. Интересно, что Lys 123, который входит в состав β4, также связывается с основанием гуанина через солевой мостик с фосфатным остовом, а также за счет ван-дер-ваальсова взаимодействия. Примечательно, что мутация в Lys 123 (K123R) была связана со значительной патологией (14) (рис. 5B). Рассматривая A-цепь IRF4, узнавание последовательности GAAA происходит только через Lys 103, который создает водородную связь с N7 и O6 гуанинового основания.Контакт также распространяется на второе основание (аденин) и опосредуется сетью ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Примечательно, что два основания перед последовательностью распознавания (GAGAAA) имитируют часть последовательности распознавания IRF и имеют контакты с Arg 98, Cys 99, Asn 102 и Lys 103. Более конкретно, между стороной гуанидиния образуется солевой мостик. цепь Arg 98 и фосфатный остов гуанина. Основание аденина распознается Cys 99, который образует водородный контакт с Cys99.Asn 102 также образует водородную связь с гуаниновым основанием. Некоторые из этих взаимодействий сопоставимы с консервативными взаимодействиями, наблюдаемыми в цепи B IRF4, что указывает на некоторую степень «молекулярного зеркального отражения» в распознавании ДНК (рис. 5C).

Рисунок 5.

Обзор взаимодействия IRF4-ДНК. ( A ) Принципиальная схема взаимодействия IRF4 с ДНК. Цепи А и В IRF4 окрашены в зеленый и оранжевый цвета соответственно. Линии представляют собой водородные связи.( B ) Карикатура, показывающая взаимодействие спирали узнавания цепи A IRF4 / ДНК. ( C ) Карикатура, изображающая спираль узнавания B цепи IRF4 / взаимодействие ДНК. IRF4; зеленый, спираль узнавания; розовый и ДНК; синий.

Рисунок 5.

Обзор взаимодействия IRF4-ДНК. ( A ) Принципиальная схема взаимодействия IRF4 с ДНК. Цепи А и В IRF4 окрашены в зеленый и оранжевый цвета соответственно. Линии представляют собой водородные связи. ( B ) Карикатура, показывающая взаимодействие спирали узнавания цепи A IRF4 / ДНК.( C ) Карикатура, изображающая спираль узнавания B цепи IRF4 / взаимодействие ДНК. IRF4; зеленый, спираль узнавания; розовый и ДНК; синий.

50″ data-legacy-id=»SEC4″> ОБСУЖДЕНИЕ

Совместное связывание факторов транскрипции имеет решающее значение для функционального результата целевого гена.IRF4 представляет собой лимфоидный фактор транскрипции, который обеспечивает его функцию как гомодимера, так и гетеродимера в сочетании с другими ДНК-связывающими белками. Молекулярный переключатель между взаимодействием гомо / гетеродимер-ДНК является критическим для регуляции судьбы клетки-мишени. В B-клетках, например, было показано, что связывание IRF4 с ISRE сдвигает программу транскрипции в сторону дифференцировки плазматических клеток, в то время как его совместное связывание с PU.1 и мотивами EICE способствует активации B-клеток и B-клеток зародышевого центра (GC). ответ (24).Принимая во внимание, что выбор взаимодействия гомо и гетеродимеров / ДНК является ключевым фактором, определяющим исход клеточной судьбы, опосредованный IRF4, принципиально важно, чтобы мы понимали лежащие в основе структурные различия между гомо- и гетеродимерными комплексами IRF4-ДНК. Структура, о которой мы здесь сообщали, дает представление о молекулярной основе сборки гомодимерного комплекса IRF4 / ДНК. Благодаря этой структуре были картированы ключевые молекулярные различия, которые отличают гомодимерный комплекс от его гетеродимерного аналога.Наше исследование показывает, что в отличие от гетеродимерного комплекса, образование гомодимерного комплекса IRF4 / ДНК ограничивается исключительно контактами белок-ДНК. Сходный паттерн кооперативного связывания наблюдался также в нескольких других хорошо охарактеризованных двудольных ДНК-связывающих белках. Например, ДНК-связывающий домен POU фактора транскрипции Oct-1 и его взаимодействующий партнер POU-специфический домен демонстрировали совместное связывание независимо от контактов белок-белок (41). Аналогичным образом, кристаллическая структура ATF-2 / c-Jun и IRF3, связанных с энхансером интерферона-β, не показала прямого контакта между взаимодействующими доменами IRF3 (42).Взятые вместе, это демонстрирует, что кооперативность в связывании в значительной степени обусловлена ​​аллостерическими эффектами, передаваемыми через ДНК, без вклада, возникающего из-за прямого межбелкового взаимодействия взаимодействующих ДНК-связывающих доменов. Примечательно, однако, что отсутствие прямого белок-белкового взаимодействия, как было показано, ставит под угрозу общую общую аффинность связывания комплекса. Например, в случае взаимодействия PU.1 / IRF4 / ДНК, белок-белковый контакт между PU.1 и ДНК-связывающим доменом IRF4, как было показано, вносит вклад в общее связывание ДНК в 20-40 раз (27 , 28).Поскольку гомодимерное взаимодействие IRF4 / ДНК лишено какого-либо белок-белкового взаимодействия, наше исследование дает правдоподобное объяснение более низкой аффинности связывания, которая обычно наблюдается для ДНК ISRE (43).

Структура IRF4, представленная здесь, также обнаружила структурное сходство с ее апо-формой, за исключением соединительной петли L1, которая показала наибольшее среднеквадратичное отклонение из всех структурных компонентов. Это позволило Lys 59 и Tyr 62 напрямую контактировать с консенсусной последовательностью, что, насколько нам известно, не наблюдается в других комплексах IRF / ДНК.Мутация этих остатков указывает на то, что их взаимодействия играют важную роль в распознавании ДНК. Неожиданно замена Tyr 62 на аланин оказала заметное влияние на аффинность связывания по сравнению с эквивалентной мутацией Lys 59, предполагая, что гидрофобная боковая цепь может вносить вклад в связывание, возможно, за счет аллостерического эффекта. Структура IRF3 и IRF7 также демонстрирует аналогичную гибкость соединительного контура L1, что вместе с нашей структурой показывает, что этот контур по своей сути является гибким.Примечательно, что эта врожденная гибкость, как было показано, оказывает прямое влияние на связывание ДНК для IRF3 и IRF7 (44). В совокупности это указывает на то, что гибкая природа петли L1 может дать представление о том, как разные IRF могут контролировать специфичность ДНК.

Другим ключевым открытием нашей структуры является способность высококонсервативных остатков (Arg 98, Cys 99 и Asn 102) в спирали узнавания α3 взаимодействовать как с консенсусными, так и с неконсенсусными элементами последовательностей ДНК. Обычно известно, что эти остатки специфически распознают консенсусную последовательность GAAA целевой ДНК.В то время как один из связывающих IRF4 доменов следует стандартному паттерну распознавания ДНК, связывание с другим связывающим доменом ДНК опосредуется неконсенсусной последовательностью, расположенной выше второй последовательности распознавания (GAGAAA). Было показано, что эти вышестоящие нуклеотиды (подчеркнутые GA) играют важную роль во взаимодействии IRF4. Интересно, что эти вышестоящие гуаниновые и адениновые основания, как было показано, играют важную роль в опосредованном IRF4 распознавании и гомодимеризации ISRE. Примечательно, что мутация GA в CG, как было показано, блокирует димеризацию IRF4 (24), тем самым подтверждая нашу структуру.

Этот атипичный способ взаимодействия можно объяснить необычным расстоянием между основаниями между консенсусной последовательностью, где четыре основания разделяют эти последовательности (GAAACCGAGAAA). Обычно последовательности распознавания IRF разделены двумя основаниями; однако в настоящее время общепризнано, что это расстояние варьируется среди ДНК-мишеней. Примечательно, что было идентифицировано несколько естественных сайтов связывания IRF с атипичным расположением (34), которые, как было показано, сильно влияют на способ, которым остатки горячих точек вносят вклад во взаимодействие консенсусной последовательности.Например, расстояние между 3 основаниями в положительных регуляторных доменах (PRD) энхансера IFN-β позволило одному из ДНК-связывающих доменов IRF3 связываться с аналогичной неконсенсусной последовательностью со специфическими взаимодействиями, возникающими из этих остатков горячих точек. (45). Аналогичным образом, ДНК-связывающий домен IRF7 в кристаллической структуре комплекса IRF-3 / IRF-7 / NFkB, связанный с PRD энхансера IFN-β, демонстрирует аналогичное взаимодействие, когда консервативный Arg 98 (Arg 96 в IRF7) взаимодействует с основаниями. перед консенсусной последовательностью (46).Вместе это исследование еще раз подтверждает идею о том, что факторы транскрипции IRF удивительно универсальны в связывании со своей целевой ДНК.

Структура гомодимера также обеспечивает структурное понимание усиления функции мутации IRF4 ^L116R , выявленной у пациентов с ХЛЛ. Хотя биохимические и клеточные основы этой мутации хорошо установлены, неясно, может ли эта усиленная функция быть связана с повышенным связыванием ДНК и / или повышенной структурной стабильностью.Структура показывает, что деформация ДНК позволяет Leu 116 располагаться близко к ДНК. Мутация Leu 116 на аргинин привела к увеличению взаимодействия ДНК в 3–4 раза, что позволяет предположить, что усиление функции, скорее всего, связано с усилением связывания с ДНК-мишенью. Однако неизвестно, относится ли это повышенное связывание также к гетеродимерной форме. Также неизвестны аллостерические эффекты замены аргинина на близлежащие остатки и его влияние на общую аффинность связывания ДНК.

В совокупности это исследование предоставило ценные структурные открытия на молекулярной основе образования гомодимерного комплекса IRF4 / ДНК.Было показано, что кооперативное связывание управляется исключительно конформационной адаптивностью ДНК, и показано, что петля L1 является очень гибкой, особенностью, присущей нескольким факторам транскрипции IRF. Мы также показали, что остатки горячих точек в ДНК-связывающем домене IRF4 взаимодействуют как с консенсусными, так и с неконсенсусными последовательностями ДНК. Основываясь на исследованиях аффинности, мы также обнаружили, что усиление функции IRF4 ^L116R может быть связано с его более прочным связыванием с ДНК. Учитывая, что молекулярное переключение между гомо и гетеродимерным взаимодействием определяет программу развития и исход клеточной судьбы В-клеток, наше исследование прокладывает путь к лучшему пониманию IRF4 в регуляции В-клеток и связанных с ними болезненных состояний.

59″ data-legacy-id=»SEC6″> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

63″ data-legacy-id=»SEC7″> ФИНАНСИРОВАНИЕ

NHMRC [GNT1079648to A.E.]. Финансирование платы за открытый доступ: Австралийский национальный университет.

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

Общая структура мышиного комплекса ATF uPAR. Структура …

Контекст 1

… Селективность взаимодействия uPA uPAR —Чтобы сделать возможным первое количественное определение величины видового барьера во взаимодействии uPA ⅐ uPAR с помощью поверхностного плазмонного резонанса, соответствующий человеческий и мышиные про-uPA и uPAR экспрессировали в виде секретируемых рекомбинантных белков клетками S2 дрозофилы и очищали с помощью аффинной хроматографии.Исследования взаимодействия очищенного muPAR и иммобилизованного muPA с помощью поверхностного плазмонного резонанса (рис.1) выявили высокоаффинное взаимодействие (KD 0,17 нМ), которое сравнимо с измеренным параллельно для ортологичных компонентов человека (KD 0,24 нМ). ). Это сходство распространяется и на отдельные кинетические константы скорости. Анализ соответствующих смешанных компонентов человека и мыши ясно показывает более низкое сродство межвидовых взаимодействий. Таким образом, muPAR распознает huPA с K D в 400 раз выше по сравнению с huPAR, и этот эффект полностью вызван увеличением k off.Аналогичным образом, huPAR распознает muPA с аффинностью в 79 раз ниже по сравнению с muPAR, но в этом случае затрагиваются обе кинетические константы скорости (рис. 1 E). Хотя это кинетическое исследование выявляет относительно строгую видовую избирательность во взаимодействии uPA-uPAR, оно, тем не менее, также подчеркивает, что часто используемый аргумент о полном и бесконечном межвидовом барьере между человеком и мышью неоднозначен (31, 32, 45 ). Чтобы получить более детальное структурное представление о возможных механизмах, ответственных за это межвидовое различие, мы впоследствии решили трехмерную структуру mATF muPAR с помощью рентгеновской кристаллографии.Общая кристаллическая структура мышиного комплекса ATF uPAR. Кристаллическая структура комплекса mATF muPAR была определена до 3,1 Å и уточнена до значения R 0,238 и значения R free 0,338 (дополнительная таблица S1). По оценке PROCHECK (42), большинство остатков (91,1%) допускают геометрию двугранного угла. Кристаллы содержат два комплекса ATF uPAR в кристаллографической асимметричной единице. Модель, полученная для mATF, включает остатки 8–132, поскольку остатки 1–7 неупорядочены, напоминая предыдущие результаты для hATF в комплексе с huPAR (25–27).Плотности электронов, соответствующие остаткам 82–92 и 227–231 muPAR, также отсутствовали, и, следовательно, эти области были исключены из текущей модели. Структура, которую мы определяем для muPAR, состоит из трех гомологичных доменов LU (обозначенных DI, DII и DIII), образующих большую гидрофобную полость для связывания лиганда, аналогичную той, что наблюдается в uPAR человека (рис. 2). Плотный комплекс с mATF в первую очередь устанавливается путем захоронения ␤-шпильки из модуля GFD mATF в этой центральной полости рецептора (рис.2 Б). Два комплекса mATF muPAR, присутствующие в асимметричной элементарной ячейке, очень похожи со средним среднеквадратичным отклонением (среднеквадратичное отклонение) 1,3 Å для 1527 атомов основной цепи пептида. Во время уточнения модели между этими двумя молекулами не было наложено никаких стереохимических ограничений, что позволяет предположить, что текущая структура не нарушается эффектами упаковки кристаллов. Среднеквадратичное значение для двух mATF в элементарной ячейке составлял 0,75 Å для 496 атомов основной цепи. Кроме того, низкое среднеквадратичное значение. значения были также получены для отдельных модулей в ATF, т.е.е. GFD (0,77 Å) и крингл (0,72 Å), которые указывают на низкую гибкость линкерной области между этими модулями в связанном с рецептором состоянии в отличие от гибкости, наблюдаемой для hATF в растворе с помощью ЯМР (46). Предыдущие исследования идентифицировали N-связанные гликаны на остатках 52, 162, 172 и 200 в huPAR, экспрессируемом клетками яичника Drosophila S2 или китайского хомячка (25, 36, 47). Последовательность muPAR содержит 7 потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования в положениях 9, 52, 160, 170, 198, 231 и 259 (рис.3). В текущей структуре muPAR плотности N-связанных гликанов были четко видны при остатках 52, 160, 170 и 259 в обеих молекулах в кристаллографической асимметричной единице. Углеводы не наблюдались на остатках 9, 198 и 231. Это наблюдение превосходно согласуется с профилем гликозилирования, определенным с помощью МС (см. «Экспериментальные процедуры»). В соответствии с относительно высокой идентичностью последовательностей между белками мыши и человека (71% для uPA и 62% для uPAR, рис. 3), общая структура комплекса mATF muPAR очень похожа на его человеческий аналог (25–27). — ing an r.m.s.d. 2,5 Å для 1456 атомов основной цепи (рис. 4 A). Хотя это приводит к почти идентичной общей топологии комплексов ATF uPAR мыши и человека, заметные различия тем не менее существуют. Во-первых, между этими видами наблюдался небольшой, но четко выраженный сдвиг на 12 ° в ориентации центрального трехцепочечного ␤-листа в uPAR DIII (рис. 4 A, вставка). Эта перестройка DIII полностью согласуется с предыдущими представлениями о значительной междоменной гибкости в uPAR (24, 25).Перестановка этого ␤-листа сопровождается несколько иной организацией петли 3, соединяющей IIIE и ␤ IIIF. По сравнению с человеческим ортологом эта петля содержит один дополнительный остаток (Leu 258) в muPAR (фиг. 3), а соседний Asn 259 модифицирован N-связанным углеводом (фиг. 4 A). В huPAR Asn 259 образует междоменную водородную связь с His в DI, и гликозилирования в этой области не обнаружено (25, 27). Во-вторых, делеция 3 остатков в петле 2, соединяющей-нити ␤ IIC и ␤ IID в muPAR DII (рис.3) приводит к более короткой и структурно хорошо упорядоченной петле (остатки 130–140), как показано на рис. 4B. Соответствующая петля в huPAR (остатки 129–142) ​​длиннее и частично неупорядочена. Важно отметить, что эта петля содержит один из ключевых остатков для связывания uPA (Asp 140 в huPAR и Asp 138 в muPAR), и она подвергается значительному изменению положения на 10 Å в зависимости от лиганда, который загружается в полость гидрофобного связывания (24 , 25, 29). Интересно, что усечение этой петли в DII по 3 остатка является консервативным среди всех опубликованных последовательностей uPAR от млекопитающих, не являющихся приматами (дополнительный рис.S1). Анализ в GFD — подробный анализ лиганд-связывающих интерфейсов в структурах, решенных из комплексов uPA-uPAR человека и мыши, выявляет несколько общих, а также уникальных свойств. Как упоминалось ранее, наша кристаллическая структура комплекса mATF muPAR ясно показывает, что это взаимодействие в первую очередь регулируется погружением ␤-шпильки GFD в центральную полость muPAR (рис. 2), которая хорошо согласуется с архитектурой и функция, раскрытая для ортолога человека (25, 48). В частности, консервативная триада Lys-Tyr-Phe вместе с проксимальным Ile на конце-петли в ␤-шпильке интимно вовлечены в связывание рецепторов у обоих видов.Мы обозначаем этот консервативный интерфейс «сайт 1» (рис. 5, A, B и E). Фактически, эти четыре остатка составляют не менее 42% от общей площади контакта в muPA (дополнительная таблица S2) и 54% в huPA (25). Соответственно, 80% открытой поверхности Phe 26 в muPA, таким образом, скрывается при связывании рецептора, что составляет 100 Å 2 от общей контактной поверхности 683 Å 2 (дополнительная таблица S2). Дальнейшие доказательства существования …

Контекст 2

… Селективность взаимодействия uPA uPAR —Чтобы сделать возможным первое количественное определение величины межвидового барьера во взаимодействии uPA uPAR с помощью поверхностного плазмонного резонанса, соответствующие про-uPA и uPAR человека и мыши были экспрессированы в виде секретируемых рекомбинантных белков клетками S2 дрозофилы и очищены с помощью аффинной хроматографии.Исследования взаимодействия очищенного muPAR и иммобилизованного muPA с помощью поверхностного плазмонного резонанса (рис.1) выявили высокоаффинное взаимодействие (KD 0,17 нМ), которое сравнимо с измеренным параллельно для ортологичных компонентов человека (KD 0,24 нМ). ). Это сходство распространяется и на отдельные кинетические константы скорости. Анализ соответствующих смешанных компонентов человека и мыши ясно показывает более низкое сродство межвидовых взаимодействий. Таким образом, muPAR распознает huPA с K D в 400 раз выше по сравнению с huPAR, и этот эффект полностью вызван увеличением k off.Аналогичным образом, huPAR распознает muPA с аффинностью в 79 раз ниже по сравнению с muPAR, но в этом случае затрагиваются обе кинетические константы скорости (рис. 1 E). Хотя это кинетическое исследование выявляет относительно строгую видовую избирательность во взаимодействии uPA-uPAR, оно, тем не менее, также подчеркивает, что часто используемый аргумент о полном и бесконечном межвидовом барьере между человеком и мышью неоднозначен (31, 32, 45 ). Чтобы получить более детальное структурное представление о возможных механизмах, ответственных за это межвидовое различие, мы впоследствии решили трехмерную структуру mATF muPAR с помощью рентгеновской кристаллографии.Общая кристаллическая структура мышиного комплекса ATF uPAR. Кристаллическая структура комплекса mATF muPAR была определена до 3,1 Å и уточнена до значения R 0,238 и значения R free 0,338 (дополнительная таблица S1). По оценке PROCHECK (42), большинство остатков (91,1%) допускают геометрию двугранного угла. Кристаллы содержат два комплекса ATF uPAR в кристаллографической асимметричной единице. Модель, полученная для mATF, включает остатки 8–132, поскольку остатки 1–7 неупорядочены, напоминая предыдущие результаты для hATF в комплексе с huPAR (25–27).Плотности электронов, соответствующие остаткам 82–92 и 227–231 muPAR, также отсутствовали, и, следовательно, эти области были исключены из текущей модели. Структура, которую мы определяем для muPAR, состоит из трех гомологичных доменов LU (обозначенных DI, DII и DIII), образующих большую гидрофобную полость для связывания лиганда, аналогичную той, что наблюдается в uPAR человека (рис. 2). Плотный комплекс с mATF в первую очередь устанавливается путем захоронения ␤-шпильки из модуля GFD mATF в этой центральной полости рецептора (рис.2 Б). Два комплекса mATF muPAR, присутствующие в асимметричной элементарной ячейке, очень похожи со средним среднеквадратичным отклонением (среднеквадратичное отклонение) 1,3 Å для 1527 атомов основной цепи пептида. Во время уточнения модели между этими двумя молекулами не было наложено никаких стереохимических ограничений, что позволяет предположить, что текущая структура не нарушается эффектами упаковки кристаллов. Среднеквадратичное значение для двух mATF в элементарной ячейке составлял 0,75 Å для 496 атомов основной цепи. Кроме того, низкое среднеквадратичное значение. значения были также получены для отдельных модулей в ATF, т.е.е. GFD (0,77 Å) и крингл (0,72 Å), которые указывают на низкую гибкость линкерной области между этими модулями в связанном с рецептором состоянии в отличие от гибкости, наблюдаемой для hATF в растворе с помощью ЯМР (46). Предыдущие исследования идентифицировали N-связанные гликаны на остатках 52, 162, 172 и 200 в huPAR, экспрессируемом клетками яичника Drosophila S2 или китайского хомячка (25, 36, 47). Последовательность muPAR содержит 7 потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования в положениях 9, 52, 160, 170, 198, 231 и 259 (рис.3). В текущей структуре muPAR плотности N-связанных гликанов были четко видны при остатках 52, 160, 170 и 259 в обеих молекулах в кристаллографической асимметричной единице. Углеводы не наблюдались на остатках 9, 198 и 231. Это наблюдение превосходно согласуется с профилем гликозилирования, определенным с помощью МС (см. «Экспериментальные процедуры»). В соответствии с относительно высокой идентичностью последовательностей между белками мыши и человека (71% для uPA и 62% для uPAR, рис. 3), общая структура комплекса mATF muPAR очень похожа на его человеческий аналог (25–27). — ing an r.m.s.d. 2,5 Å для 1456 атомов основной цепи (рис. 4 A). Хотя это приводит к почти идентичной общей топологии комплексов ATF uPAR мыши и человека, заметные различия тем не менее существуют. Во-первых, между этими видами наблюдался небольшой, но четко выраженный сдвиг на 12 ° в ориентации центрального трехцепочечного ␤-листа в uPAR DIII (рис. 4 A, вставка). Эта перестройка DIII полностью согласуется с предыдущими представлениями о значительной междоменной гибкости в uPAR (24, 25).Перестановка этого ␤-листа сопровождается несколько иной организацией петли 3, соединяющей IIIE и ␤ IIIF. По сравнению с человеческим ортологом эта петля содержит один дополнительный остаток (Leu 258) в muPAR (фиг. 3), а соседний Asn 259 модифицирован N-связанным углеводом (фиг. 4 A). В huPAR Asn 259 образует междоменную водородную связь с His в DI, и гликозилирования в этой области не обнаружено (25, 27). Во-вторых, делеция 3 остатков в петле 2, соединяющей-нити ␤ IIC и ␤ IID в muPAR DII (рис.3) приводит к более короткой и структурно хорошо упорядоченной петле (остатки 130–140), как показано на рис. 4B. Соответствующая петля в huPAR (остатки 129–142) ​​длиннее и частично неупорядочена. Важно отметить, что эта петля содержит один из ключевых остатков для связывания uPA (Asp 140 в huPAR и Asp 138 в muPAR), и она подвергается значительному изменению положения на 10 Å в зависимости от лиганда, который загружается в полость гидрофобного связывания (24 , 25, 29). Интересно, что усечение этой петли в DII по 3 остатка является консервативным среди всех опубликованных последовательностей uPAR от млекопитающих, не являющихся приматами (дополнительный рис.S1). Анализ в GFD — подробный анализ лиганд-связывающих интерфейсов в структурах, решенных из комплексов uPA-uPAR человека и мыши, выявляет несколько общих, а также уникальных свойств. Как упоминалось ранее, наша кристаллическая структура комплекса mATF muPAR ясно показывает, что это взаимодействие в первую очередь регулируется погружением ␤-шпильки GFD в центральную полость muPAR (рис. 2), которая хорошо согласуется с архитектурой и функция, раскрытая для ортолога человека (25, 48). В частности, консервативная триада Lys-Tyr-Phe вместе с проксимальным Ile на конце-петли в ␤-шпильке интимно вовлечены в связывание рецепторов у обоих видов.Мы обозначаем этот консервативный интерфейс «сайт 1» (рис. 5, A, B и E). Фактически, эти четыре остатка составляют не менее 42% от общей площади контакта в muPA (дополнительная таблица S2) и 54% в huPA (25). Соответственно, 80% открытой поверхности Phe 26 в muPA, таким образом, скрывается при связывании рецептора, что составляет 100 Å 2 от общей контактной поверхности 683 Å 2 (дополнительная таблица S2). Дальнейшие доказательства существования …

Контекст 3

… Селективность взаимодействия uPA uPAR —Чтобы сделать возможным первое количественное определение величины межвидового барьера во взаимодействии uPA uPAR с помощью поверхностного плазмонного резонанса, соответствующие про-uPA и uPAR человека и мыши были экспрессированы в виде секретируемых рекомбинантных белков клетками S2 дрозофилы и очищены с помощью аффинной хроматографии.Исследования взаимодействия очищенного muPAR и иммобилизованного muPA с помощью поверхностного плазмонного резонанса (рис.1) выявили высокоаффинное взаимодействие (KD 0,17 нМ), которое сравнимо с измеренным параллельно для ортологичных компонентов человека (KD 0,24 нМ). ). Это сходство распространяется и на отдельные кинетические константы скорости. Анализ соответствующих смешанных компонентов человека и мыши ясно показывает более низкое сродство межвидовых взаимодействий. Таким образом, muPAR распознает huPA с K D в 400 раз выше по сравнению с huPAR, и этот эффект полностью вызван увеличением k off.Аналогичным образом, huPAR распознает muPA с аффинностью в 79 раз ниже по сравнению с muPAR, но в этом случае затрагиваются обе кинетические константы скорости (рис. 1 E). Хотя это кинетическое исследование выявляет относительно строгую видовую избирательность во взаимодействии uPA-uPAR, оно, тем не менее, также подчеркивает, что часто используемый аргумент о полном и бесконечном межвидовом барьере между человеком и мышью неоднозначен (31, 32, 45 ). Чтобы получить более детальное структурное представление о возможных механизмах, ответственных за это межвидовое различие, мы впоследствии решили трехмерную структуру mATF muPAR с помощью рентгеновской кристаллографии.Общая кристаллическая структура мышиного комплекса ATF uPAR. Кристаллическая структура комплекса mATF muPAR была определена до 3,1 Å и уточнена до значения R 0,238 и значения R free 0,338 (дополнительная таблица S1). По оценке PROCHECK (42), большинство остатков (91,1%) допускают геометрию двугранного угла. Кристаллы содержат два комплекса ATF uPAR в кристаллографической асимметричной единице. Модель, полученная для mATF, включает остатки 8–132, поскольку остатки 1–7 неупорядочены, напоминая предыдущие результаты для hATF в комплексе с huPAR (25–27).Плотности электронов, соответствующие остаткам 82–92 и 227–231 muPAR, также отсутствовали, и, следовательно, эти области были исключены из текущей модели. Структура, которую мы определяем для muPAR, состоит из трех гомологичных доменов LU (обозначенных DI, DII и DIII), образующих большую гидрофобную полость для связывания лиганда, аналогичную той, что наблюдается в uPAR человека (рис. 2). Плотный комплекс с mATF в первую очередь устанавливается путем захоронения ␤-шпильки из модуля GFD mATF в этой центральной полости рецептора (рис.2 Б). Два комплекса mATF muPAR, присутствующие в асимметричной элементарной ячейке, очень похожи со средним среднеквадратичным отклонением (среднеквадратичное отклонение) 1,3 Å для 1527 атомов основной цепи пептида. Во время уточнения модели между этими двумя молекулами не было наложено никаких стереохимических ограничений, что позволяет предположить, что текущая структура не нарушается эффектами упаковки кристаллов. Среднеквадратичное значение для двух mATF в элементарной ячейке составлял 0,75 Å для 496 атомов основной цепи. Кроме того, низкое среднеквадратичное значение. значения были также получены для отдельных модулей в ATF, т.е.е. GFD (0,77 Å) и крингл (0,72 Å), которые указывают на низкую гибкость линкерной области между этими модулями в связанном с рецептором состоянии в отличие от гибкости, наблюдаемой для hATF в растворе с помощью ЯМР (46). Предыдущие исследования идентифицировали N-связанные гликаны на остатках 52, 162, 172 и 200 в huPAR, экспрессируемом клетками яичника Drosophila S2 или китайского хомячка (25, 36, 47). Последовательность muPAR содержит 7 потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования в положениях 9, 52, 160, 170, 198, 231 и 259 (рис.3). В текущей структуре muPAR плотности N-связанных гликанов были четко видны при остатках 52, 160, 170 и 259 в обеих молекулах в кристаллографической асимметричной единице. Углеводы не наблюдались на остатках 9, 198 и 231. Это наблюдение превосходно согласуется с профилем гликозилирования, определенным с помощью МС (см. «Экспериментальные процедуры»). В соответствии с относительно высокой идентичностью последовательностей между белками мыши и человека (71% для uPA и 62% для uPAR, рис. 3), общая структура комплекса mATF muPAR очень похожа на его человеческий аналог (25–27). — ing an r.m.s.d. 2,5 Å для 1456 атомов основной цепи (рис. 4 A). Хотя это приводит к почти идентичной общей топологии комплексов ATF uPAR мыши и человека, заметные различия тем не менее существуют. Во-первых, между этими видами наблюдался небольшой, но четко выраженный сдвиг на 12 ° в ориентации центрального трехцепочечного ␤-листа в uPAR DIII (рис. 4 A, вставка). Эта перестройка DIII полностью согласуется с предыдущими представлениями о значительной междоменной гибкости в uPAR (24, 25).Перестановка этого ␤-листа сопровождается несколько иной организацией петли 3, соединяющей IIIE и ␤ IIIF. По сравнению с человеческим ортологом эта петля содержит один дополнительный остаток (Leu 258) в muPAR (фиг. 3), а соседний Asn 259 модифицирован N-связанным углеводом (фиг. 4 A). В huPAR Asn 259 образует междоменную водородную связь с His в DI, и гликозилирования в этой области не обнаружено (25, 27). Во-вторых, делеция 3 остатков в петле 2, соединяющей-нити ␤ IIC и ␤ IID в muPAR DII (рис.3) приводит к более короткой и структурно хорошо упорядоченной петле (остатки 130–140), как показано на рис. 4B. Соответствующая петля в huPAR (остатки 129–142) ​​длиннее и частично неупорядочена. Важно отметить, что эта петля содержит один из ключевых остатков для связывания uPA (Asp 140 в huPAR и Asp 138 в muPAR), и она подвергается значительному изменению положения на 10 Å в зависимости от лиганда, который загружается в полость гидрофобного связывания (24 , 25, 29). Интересно, что усечение этой петли в DII по 3 остатка является консервативным среди всех опубликованных последовательностей uPAR от млекопитающих, не являющихся приматами (дополнительный рис.S1). Анализ в GFD — подробный анализ лиганд-связывающих интерфейсов в структурах, решенных из комплексов uPA-uPAR человека и мыши, выявляет несколько общих, а также уникальных свойств. Как упоминалось ранее, наша кристаллическая структура комплекса mATF muPAR ясно показывает, что это взаимодействие в первую очередь регулируется погружением ␤-шпильки GFD в центральную полость muPAR (рис. 2), которая хорошо согласуется с архитектурой и функция, раскрытая для ортолога человека (25, 48). В частности, консервативная триада Lys-Tyr-Phe вместе с проксимальным Ile на конце-петли в ␤-шпильке интимно вовлечены в связывание рецепторов у обоих видов.Мы обозначаем этот консервативный интерфейс «сайт 1» (рис. 5, A, B и E). Фактически, эти четыре остатка составляют не менее 42% от общей площади контакта в muPA (дополнительная таблица S2) и 54% в huPA (25). Соответственно, 80% открытой поверхности Phe 26 в muPA, таким образом, скрывается при связывании рецептора, что составляет 100 Å 2 от общей контактной поверхности 683 Å 2 (дополнительная таблица S2). Еще одно свидетельство существования …

Проведение испытаний высоких деревянных домов на повышение температуры и возгорания

Автор: Ребекка Уоллес, Лаборатория лесных товаров, U.С. Лесная служба в Лесное хозяйство

4 августа 2021 г.

Полностью охваченное кросс-ламинатом здание во время первого испытания. (Фотография предоставлена ​​Лаурой Хасбург).

Деревянные здания обеспечивают ряд экономических и экологических преимуществ для своих сообществ, и растет интерес к использованию этих преимуществ путем строительства средних и высотных зданий с использованием поперечно-клееной древесины (CLT).

CLT изготавливается из слоев высушенных деревянных досок, уложенных в чередующемся направлении под углом 90 градусов, которые затем склеиваются и прессуются, образуя сплошные панели. Эти панели обладают исключительной прочностью и стабильностью и могут использоваться в качестве стен, крыш и полов. Кроме того, оценки показали, что семидюймовый пол из CLT имеет огнестойкость в течение двух часов.

Дизайн Мэри Хорнинг, Лесная служба США.

Чтобы деревянные конструкции поднимались выше шести этажей без специального официального разрешения на строительство, необходимо пересмотреть Международный строительный кодекс.Это может показаться сложной задачей, но исследователи из Лаборатории лесных товаров (FPL) Лесной службы недавно завершили серию испытаний на огнестойкость, которые устранят опасения по поводу огнестойкости деревянных зданий и помогут вывести их на новый уровень.

В сотрудничестве с Американским советом по древесине, Бюро по алкоголю, табаку, огнестрельному оружию и взрывчатым веществам (ATF) и Государственным и частным лесным хозяйством Лесной службы исследователи FPL недавно воссоздали пять сценариев пожара в двухэтажном полномасштабном испытании. здание построено с использованием CLT.Результаты были многообещающими.

«Эти испытания демонстрируют, что можно построить здание из CLT, которое будет огнестойким, даже с незащищенным CLT», — сказал Сэм Зелинка, руководитель проекта отдела строительных и пожарных наук в FPL.

Исследователи Лаборатории лесных товаров воссоздали пять сценариев пожара в двухэтажном полномасштабном испытательном здании, построенном из поперечно-клееной древесины. В сценариях пожара были проверены различные варианты расположения открытых и неэкспонированных перекрестно-ламинированных деревянных досок с открытыми дверями между жилой и спальной зонами.(Фото: Лора Хасбург.)

Испытательное здание, построенное в лаборатории пожарных исследований ATF в Белтсвилле, штат Мэриленд, состояло из двух идентичных меблированных квартир с одной спальней. Сценарии проверяли различные варианты расположения открытых и неэкспонированных CLT с открытыми дверями между жилой и спальной зонами.

Также была оценена эффективность автоматической спринклерной системы. По словам Лауры Хасбург, инженера по противопожарной защите FPL, это последнее испытание было самым захватывающим, потому что никто не знал, чего ожидать от полностью открытых стен и потолков из CLT.Ранее подобных тестов в таком масштабе не проводилось, и результаты оказались весьма впечатляющими.

«Пожару давали гореть в течение 23 минут, прежде чем была активирована спринклерная система», — пояснил Хасбург.

Температура взлетела примерно до 700 градусов по Цельсию, но как только спринклеры были активированы, цифры снизились примерно до 50 градусов по Цельсию за считанные минуты. Хасбург добавил, что второй и третий тесты были весьма примечательными, потому что даже при обнажении CLT огонь естественным образом угас.

Продолжительность испытаний варьировалась от восьми минут (когда спринклеры сразу включались) до четырех часов, а данные собирались один раз в секунду в 500 точках по всей конструкции. После анализа данных результаты будут опубликованы в отчете FPL и представлены Специальному комитету Совета Международного кодекса по высотным деревянным домам.

«Это испытание имеет решающее значение для понимания характеристик деревянных зданий в условиях пожара, поэтому отрасль может продолжить работу по обеспечению безопасности жителей и реагированию на пожарных», — сказал Шон ДеКрейн, председатель рабочей группы по пожарным испытаниям и менеджер по связям с отраслью для Технологии строительства и безопасности жизнедеятельности в Underwriters Laboratories.

Результаты этих испытаний не только помогут информировать строительные нормы и правила, но также предоставят полезную информацию для групп по страхованию имущества, внесут вклад в более точное моделирование поведения при пожаре и приведут к более безопасному тушению пожара в зданиях CLT.

Испытания показали, что можно построить здание из CLT, которое будет огнестойким, даже с незащищенным CLT. Результаты этих испытаний не только помогут информировать строительные нормы и правила, но также предоставят полезную информацию для групп по страхованию имущества, внесут вклад в более точное моделирование поведения при пожаре и приведут к более безопасному тушению пожара в зданиях CLT.(Фото: Лора Хасбург.)

Написать ответ

Комментарии

Подача заявок на получение разрешения на жилищное строительство | Остров Бейнбридж, штат Вашингтон

В каждой отправляемой заявке должно использоваться соглашение об именах, указанное ниже. Представленные исправления должны быть названы так же, как и исходные заявки, и включать REV 1, REV 2 и т. Д. После названия. (Например, план участка REV 1.)

Обратите внимание, что городские власти больше не принимают бумажные документы.

Адрес

Заявка на запрос или подтверждение адреса

Карта окрестностей — Должна включать адрес адресуемой территории, а также близлежащие участки с указанием существующих и предлагаемых участков подъездных путей.

Plat Utilities (PU)

Инженерный план дренажа

Градиентный план

Заявка на проект

Заявка на подъезд к дорогам

План проезжей части

Отчет о предотвращении загрязнения ливневыми водами

План инженерных коммуникаций

Дополнительный жилой дом (R-ADU)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

MR # 2 — План по предотвращению загрязнения ливневыми водами Описательный рабочий лист

Заявка на подъезд к дорогам

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Пристройка жилых домов (R-ADD)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

Рабочий лист планов управления ливневыми водами и предотвращением загрязнения на территории жилых домов

Заявка на подъезд к дорогам

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилые дома после фактов (R-ATF)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсап

Заявка на проект

План участка

Расчет конструкций

Комплект структурных планов (все листы должны должны быть объединены в один документ.)

Перестройка жилых домов (R-ALT)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсап

Заявка на проект

План участка

Расчет конструкций

Комплект структурных планов (все листы должны должны быть объединены в один документ.)

Перестройка жилых помещений — Подлежит проверке на месте (R-ALT STFI)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ, а должен включать как существующий, так и предлагаемый этаж) план.)

Рабочий лист энергетического кодекса (если применимо)

Документация округа общественного здравоохранения Китсап (если применимо)

Заявка на проект

Описание проекта

План участка

Набор структурных планов (Если применимо к объему работ. Все листы должны быть объединены в один документ и включают структурные расчеты.)

Жилая переборка (R-BLK)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Навес для дома (R-CAR)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор гражданских планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Документация округа общественного здравоохранения Китсап

Проект Приложение

MR # 2 — План предотвращения загрязнения ливневыми водами Описательный лист

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Residential Deck (R-DEC)

Architectural Plan Set (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Civil Plan Set (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Kitsap Public Документация округа здравоохранения

Заявка на проект

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ)

Снос жилого дома (R-DEM)

Заявка на проект

План участка

Жилой забор (R-FEN)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Бытовая система пожарной сигнализации (R-FIA)

Планы пожарной сигнализации

Заявка на проект

Бытовая система пожаротушения (R-FIS)

План пожарных спринклерных установок

Заявка на проект

Жилой фонд Только (R-FND)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Планировка и заполнение жилого дома (R-GAF)

Заявка на проект

Заявка на подъезд к дороге

План участка

Жилой гараж (R-GAR)

Набор архитектурных планов (все листы должны быть объединены в один документ .)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

Заявка на подъезд дороги

План участка

Расчет конструкции

Структурный план Набор (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилой гостевой дом (R-GST)

Заявка на запрос или подтверждение адреса

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

MR # 2 — План по предотвращению загрязнения ливневыми водами Описательный рабочий лист

Заявка на подъезд к дорогам

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилой передвижной дом (R-MBH)

Заявка на запрос или подтверждение адреса

Набор архитектурных планов (Все листы необходимо объединить в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

MR # 2 — План предотвращения загрязнения ливневыми водами Описательный рабочий лист

Заявка на подъезд к дорогам

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ)

Бытовая механика (R-MEC — только онлайн-разрешение)

План участка

Листы спецификаций

Жилые многоквартирные дома (R-MFR)

Заявка на запрос или подтверждение адреса

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

Рабочий лист планов управления ливневыми водами и предотвращения загрязнения на территории жилых домов

Заявление о подъезде к дорогам

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Разное жилое (R-MIS)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ. .)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилое водоснабжение (только онлайн-разрешение R-PLM)

Заявка на проект

Жилой бассейн (R-POL)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Замена крыши в жилом доме (R-REF)

Контракт, разрешающий выполнение работ (подписанный владельцем собственности)

Ремонт жилого дома (R-REP)

Набор архитектурных планов (все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор планов строительства (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Подпорная стена жилого дома (R-RET)

Комплект архитектурного плана (Все листы должны быть объединены в один документ)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Заявка на проект

План участка

Расчеты конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилой дом на одну семью (R-SFR)

Заявление на запрос адреса или подтверждение

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор гражданских планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

MR # 2 — План предотвращения загрязнения ливневыми водами Описательный рабочий лист

Заявление о подъезде к дорогам

Заявление SAR

План участка

Структурный Расчеты

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилой сарай (R-SHD)

Комплект архитектурного плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Комплект гражданского плана (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Kitsap Public Документация округа здравоохранения

Заявка на проект

MR # 2 — План предотвращения загрязнения ливневыми водами Описательный лист

План участка

Расчет конструкций

Набор структурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Солнечные панели для жилых помещений (только онлайн-разрешение R-SOL)

Контракт, разрешающий выполнение работ (подписанный владельцем собственности)

План участка

Листы спецификаций

Жилой резервуар для хранения (R-STR)

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Наборы гражданских планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

План участка

Расчет конструкций

Набор планов конструкций (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Жилой офис / студия (R-STU)

Заявка на запрос или подтверждение адреса

Набор архитектурных планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Набор гражданских планов (Все листы должны быть объединены в один документ.)

Рабочий лист энергетического кодекса

Документация округа общественного здравоохранения Китсапа

Заявка на проект

MR # 2 — План предотвращения загрязнения ливневыми водами Описательный рабочий лист

Заявка на подъезд к дорогам

План участка

Структурные расчеты

Комплект (Все листы необходимо объединить в один документ.)

Пересмотр выданного разрешения (нам нужно просмотреть это для конкретных документов) РЕДАКЦИЯ

Заявка на пересмотр

Представленные связанные планы и детали.

Способ передвижения (ПЕРЕИМЕНОВАНИЕ ДОРОГИ Подъездная дорожка Официальное название (d) через COBI) ??

Заявка на запрос адреса или подтверждение

Петиция об названии дороги

План участка

Разрешение на отъезд (ROW)

Это разрешение находится в ведении Департамента общественных работ.